花椒多酚類化合物對慢性應(yīng)激抑郁大鼠的治療作用機(jī)制研究

周 皎 ，木海鷗 ，王 瑋

(1.浙江省溫州市第三人民醫(yī)院，浙江 溫州 325000; 2.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，浙江 溫州 325027)

抑郁癥是一種情感障礙性精神疾病，其終生患病率為5.2% ～16.2%，女性高達(dá)25%[1]。抑郁癥的發(fā)生機(jī)制涉及到交感神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等多個(gè)方面[2]。慢性應(yīng)激較好地模擬了人類抑郁樣癥狀，其主要特征為機(jī)體受到內(nèi)外環(huán)境刺激后發(fā)生下丘腦－垂體－腎上腺軸功能失調(diào)及免疫系統(tǒng)功能紊亂，由此引發(fā)各種行為和功能的改變[3－4]。花椒多酚類化合物(ZPPC)為蕓香科植物青椒 Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc.或花椒 Zanthoxylum bungeanum Maxim.的干燥成熟果皮，具有溫中止痛、驅(qū)蟲、外用燥濕、殺蟲止癢的功效[5]，主要化學(xué)成分為生物堿、酰胺、木脂素、香豆素、揮發(fā)油和脂肪酸等。筆者以四川漢源花椒為研究對象，研究了花椒總多酚類化合物的抗抑郁作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

動(dòng)物:雄性SD大鼠，二級，體重200～220 g。飼養(yǎng)條件為每籠4只，溫度(24±1)℃，相對濕度(50±10)%，自然光照，晝夜節(jié)律，自由攝食飲水。所有動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境3 d后開始試驗(yàn)，試驗(yàn)前禁食10 h，飲水自由。

試藥:花椒購自四川九襄;粉碎后用丙酮－水溶液(7∶3)浸提，減壓除去浸提液中丙酮，然后過濾殘留水液，將濾液經(jīng)醋酸乙酯萃取分離，脫水干燥，得到ZPPC總粗提取物(得率為0.033%)，為黃棕色粉末，試驗(yàn)前用雙蒸水配成所需濃度。丙咪嗪、皮質(zhì)酮和白細(xì)胞介素1β(IL－1β)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒均購自美國RD公司。其他常規(guī)試劑均為分析純。

儀器:DigBehv動(dòng)物行為分析系統(tǒng)(上海吉量軟件科技有限公司);BS110S型分析天平(北京賽多利斯儀器公司);醫(yī)用離心機(jī)(金壇市醫(yī)療器械廠);DMSL型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(金華科迪儀器設(shè)備有限公司);550型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國Bio－Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠慢性應(yīng)激模型的建立與分組

按文獻(xiàn)[6]方法制作大鼠模型。每日測定體重，按體重連續(xù)給藥21 d，第21天進(jìn)行行為測試，斷頭殺鼠。將40只慢性應(yīng)激模型大鼠隨機(jī)均分為5組，即應(yīng)激模型組，低、中、高劑量ZPPC組和丙咪嗪組。低、中、高劑量ZPPC組分別于測試前60 min按體重灌胃給予50，100，200 mg/kg的ZPPC;丙咪嗪組于測試前30 min按體重腹腔注射以雙蒸水溶解為10 mg/kg的丙咪嗪。另取8只正常大鼠，設(shè)為正常對照組，正常對照組和應(yīng)激模型組均灌胃給予等體積雙蒸水。

1.2.2 開野試驗(yàn)[7]

在給予慢性應(yīng)激21 d后，各組大鼠均開始本試驗(yàn)。正方形開野實(shí)驗(yàn)箱為80 cm×80 cm×75 cm，底板用筆畫成10 cm×10 cm的方格，其正上方距離底板90 cm高處放一只60 W白熾燈泡。將大鼠放于開野箱中央測試10 min，觀察后5 min內(nèi)大鼠的活動(dòng)情況，包括自主活動(dòng)次數(shù)(方格間穿行次數(shù))、豎起及探究次數(shù)(兩前肢離地1 cm以上的次數(shù))。

1.2.3 大鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)[8]

在連續(xù)給予ZPPC 14 d后進(jìn)行試驗(yàn)。正式測試前24 h，將大鼠置水深23 cm的玻璃圓缸(高 40 cm，直徑 18 cm)內(nèi)，水溫(24±1)℃，作強(qiáng)迫游泳訓(xùn)練15 min。在末次給藥后60 min(ZPPC，灌胃給藥)或30 min(丙咪嗪，腹腔注射給藥)，再次將大鼠置水深23 cm的玻璃圓缸內(nèi)強(qiáng)迫游泳5 min，觀察并記錄5 min內(nèi)大鼠的不動(dòng)時(shí)間。當(dāng)大鼠停止掙扎，浮在水中保持不動(dòng)，或僅做一些必要的輕微動(dòng)作保持頭部浮在水面上的時(shí)間視為不動(dòng)時(shí)間。

1.2.4 血清皮質(zhì)酮和IL－1β水平測定

取全血5～10 mL，室溫放置20 min后以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ妹嘎?lián)免疫吸附試驗(yàn)雙抗體夾心法測定大鼠血清中皮質(zhì)酮和IL－1β的含量，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明操作。

1.2.5 腎上腺皮質(zhì)厚度測定

大鼠處死后摘取腎上腺，放入10%甲醛溶液固定，經(jīng)脫水、透明、包埋后切片，HE染色鏡檢、照相。采用圖像分析軟件測定腎上腺皮質(zhì)厚度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(±s)表示，藥物作用以單向方差分析方法進(jìn)行分析，組間差異(P ＜0.05)采用 Dunnett’s t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對開野箱中活動(dòng)性的影響

如表1所示，與正常大鼠相比，慢性應(yīng)激模型大鼠爬行格數(shù)、豎立及探究次數(shù)均明顯減少(P＜0.001);而在給予不同劑量(50，100，200 mg/kg)ZPPC后，應(yīng)激大鼠行為明顯改善，爬行格數(shù)、豎立及探究次數(shù)均出現(xiàn)不同程度的增加。

表1 ZPPC對慢性應(yīng)激大鼠活動(dòng)性的影響(± s，n=8)

表1 ZPPC對慢性應(yīng)激大鼠活動(dòng)性的影響(± s，n=8)

注:與正常對照組比較，#P＜0.001;與應(yīng)激模型組比較，＊P＜0.01，▲P ＜0.001。

正常對照組應(yīng)激模型組低劑量ZPPC組中劑量ZPPC組高劑量ZPPC組丙咪嗪組50 100 200 10 54.4 ±8.8 26.1 ±7.6#32.8 ±4.5＊41.0 ±4.8▲52.9 ±5.2▲4.3 ±0.7▲20.0 ± 3.5 7.1 ± 4.0#11.1 ± 4.0＊15.6 ± 3.4▲20.3 ± 2.9▲4.6 ± 0.8＊

2.2 對強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響

與正常大鼠相比，慢性應(yīng)激模型大鼠在強(qiáng)迫游泳中的不動(dòng)時(shí)間大幅增加，差異有顯著性(P＜0.001);ZPPC能劑量依賴性地減少應(yīng)激大鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)。結(jié)果見圖1。

圖1 ZPPC對慢性應(yīng)激大鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間的影響(± s，n=8)

2.3 對腎上腺皮質(zhì)厚度及血清皮質(zhì)酮水平的影響

與正常大鼠相比，應(yīng)激大鼠腎上腺皮質(zhì)厚度明顯增加(P＜0.001)，而給藥組大鼠的腎上腺皮質(zhì)厚度較應(yīng)激模型組均有所減少(P＜0.01)。同時(shí)，應(yīng)激模型組大鼠血清皮質(zhì)酮含量明顯高于正常對照組大鼠(P＜0.001)，各給藥組皮質(zhì)酮含量明顯下降，與應(yīng)激模型組相比差異有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.001)。結(jié)果見表 2。

表2 ZPPC對慢性應(yīng)激大鼠腎上腺皮質(zhì)厚度和血清皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度的影響(± s，n=8)

表2 ZPPC對慢性應(yīng)激大鼠腎上腺皮質(zhì)厚度和血清皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度的影響(± s，n=8)

注:與正常對照組比較，#P＜0.001;與應(yīng)激模型組比較，＊P＜0.05，△P ＜0.01，▲P ＜0.001。

組別正常對照組應(yīng)激模型組低劑量ZPPC組中劑量ZPPC組高劑量ZPPC組丙咪嗪組劑量(mg/kg)50 100 200 10腎上腺皮質(zhì)厚度(μm)693.1 ± 5.8 959.6 ± 3.7#756.6 ±6.2△725.3 ±6.0△715.4 ±3.6△699.3 ±9.0▲皮質(zhì)酮質(zhì)量濃度(ng/mL)64.4 ±9.3 101.1 ±6.9#93.5 ±10.3＊83.5 ±6.7△75.4 ±4.5▲70.1 ±7.8▲

2.4 對血清IL－1β水平的影響

如圖2所示，應(yīng)激模型組大鼠血清IL－1β水平顯著高于正常對照組(P＜0.001)，50，100，200 mg/kg ZPPC 組和丙咪嗪 10 mg/kg組對慢性應(yīng)激所致IL－1β水平上升具有明顯的抑制作用，與應(yīng)激模型組相比差異有顯著性(P ＜0.05，P ＜0.01，P ＜0.001)。

圖2 ZPPC對慢性應(yīng)激大鼠血清IL－1β水平的影響(± s，n=8)

3 討論

抑郁癥的病因尚不能徹底闡明，目前認(rèn)為長期慢性、低水平的應(yīng)激源是促進(jìn)抑郁發(fā)生、發(fā)展的主要原因。慢性不可預(yù)知性大鼠應(yīng)激模型就是根據(jù)此理論建立的，其特點(diǎn)是應(yīng)激因子的多變性和不可預(yù)知性，這一模型已成為國內(nèi)外學(xué)者探討抑郁癥發(fā)病機(jī)制和抗抑郁藥作用機(jī)理時(shí)廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型[9]。

本試驗(yàn)中大鼠經(jīng)21 d的慢性綜合性應(yīng)激后，在開野試驗(yàn)中5 min內(nèi)的爬行格數(shù)和探究次數(shù)明顯減少，說明應(yīng)激模型組大鼠活動(dòng)能力下降、緊張程度增加且興趣喪失;本試驗(yàn)用經(jīng)典的大鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)來反映大鼠對絕望的反應(yīng)程度，游泳不動(dòng)時(shí)間增加提示大鼠對環(huán)境的絕望增加。而在給予慢性應(yīng)激大鼠不同劑量(50，100，200 mg/kg)ZPPC灌胃治療后，大鼠活動(dòng)性增強(qiáng)，對外周環(huán)境的探究興趣增加，在強(qiáng)迫游泳中的絕望不動(dòng)時(shí)間也減少，提示ZPPC可以顯著改善應(yīng)激大鼠的抑郁癥狀，增加抑郁大鼠的活動(dòng)性及對絕望的抵抗能力。

越來越多的研究顯示[10]，神經(jīng)－內(nèi)分泌－免疫系統(tǒng)之間存在著復(fù)雜的相互關(guān)系，免疫功能低下是抑郁癥的特征之一。ZPPC和經(jīng)典抗抑郁藥丙咪嗪不僅能逆轉(zhuǎn)應(yīng)激抑郁大鼠行為表現(xiàn)的異常，對抑郁大鼠腎上腺出現(xiàn)的病理改變，如皮質(zhì)增生、肥厚等也有明顯改善作用。本試驗(yàn)中慢性應(yīng)激模型大鼠血清IL－1β水平顯著升高，說明抑郁大鼠的免疫功能低下。給予ZPPC治療后該水平顯著下降，提示ZPPC很可能還通過改善免疫功能而減輕抑郁癥狀。總之，ZPPC可以改善慢性應(yīng)激導(dǎo)致的腎上腺結(jié)構(gòu)和功能的失衡，調(diào)整免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能，從而具有抗抑郁效果。

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