紅曲霉粗多糖的提取及含量測定

高鑫 黃先智 李競

（1西南大學藥學院，重慶400715；2西南大學蠶學與系統生物學研究所，重慶400715）

紅曲霉（Monascus）在我國的應用已經有一千多年的歷史[1]，以能產生大量的天然紅色素而著稱。紅曲霉廣泛應用于釀酒、釀醋、食品發酵、化妝品、醫藥等行業[2]。近幾十年來世界各地對紅曲霉進行了大量研究，上個世紀70年代，日本遠藤章教授從紅曲霉中分離出Monaclin K，具有降膽固醇作用[1]，引起了廣泛關注。隨著人們的食品安全意識的日益提升，紅曲霉生產的紅色素在綠色食品中得到廣泛應用。

近些年來，經科學工作者的研究證實，紅曲霉多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、增強免疫等功能[3]。本實驗通過提取紅曲霉發酵液和菌絲體內的粗多糖，并對其進行含量測定，以期為紅曲霉多糖的進一步開發利用提供參考。

1 材料與試劑儀器

1.1 材料

紅曲霉菌種購自中國農業微生物菌種保藏中心，菌種保藏編號：30344。

1.2 培養基

1.2.1 種子培養基 母種培養基為斜面PDA培養基。

1.2.2 液體搖瓶培養基 普通PDA培養基去瓊脂配方，MgSO41.5mg/L，KH2PO41.5 mg/L，VB110mg/L，自然pH。

1.3 儀器與試劑

ZD-85A氣浴恒溫振蕩器（金壇市富華儀器有限公司）、RE-52旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）、U-1800紫外分析儀（日本日立）、752N紫外可見分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）、SHZ-ⅢD型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）、KQ2200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、HH-6數顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）。三氯乙酸、苯酚、碳酸氫鈉、濃硫酸、葡萄糖、鋁片、活性炭等，所用試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 操作與培養方法

刮下斜面紅曲霉菌絲體，放入已滅菌的研缽中，研成碎塊，加入少許無菌水，研成均勻糊狀，精密吸取3 m L加入含有350 m L液體培養基的錐形瓶中，封口，整個操作過程在無菌操作臺內完成。將5個搖瓶放在25℃，170轉/min的搖床上往復式振搖7天。

2.2 紅曲霉粗多糖的提取

發酵液濾過，得菌絲體，加入水500 m L，超聲破碎細胞1小時，濾過，菌絲體加入500 m L水100℃浸提2次，每次1小時。合并4次濾液，減壓濃縮至100 m L，用10%三氯乙酸溶液調節pH至3，濾液放置冰箱24小時后，經微孔濾膜濾過去蛋白質沉淀，濾液加入乙醇，使含醇量達到80%，靜置過夜。經微孔濾膜減壓抽濾，濾渣加熱水中溶解，依上法進行醇沉，重復3次。濾渣加熱水溶解，加入1 g活性炭粉末除去色素，濾液濃縮醇沉，濾過，得淺紅色紅曲霉粗多糖，多糖平均得率為0.42 g。

2.3 紅曲霉多糖含量測定

2.3.1 對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖對照品25.78 mg，置25 m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 5%苯酚溶液的制備[4-5]取苯酚100g，加鋁片0.1 g和碳酸氫鈉0.05 g，蒸餾。收集182℃餾分5g，置100 m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，避光保藏在冰箱中備用。2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取紅曲霉粗多糖9.68mg，置10m L量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.4 吸收波長的選擇 分別精密吸取對照品溶液0.3 m L、供試品溶液0.2 m L，置10 m L量瓶中，加水至3 m L，精密加入5%苯酚溶液1 m L，搖勻；精密吸取硫酸5 m L迅速加入，振搖。冷卻后于沸水中加熱15分鐘，取出后冷卻，加水至刻線，搖勻。在400～550 nm進行波長掃描，得對照品溶液、供試品溶液的最大吸收波長都在490 nm，見圖1和圖2。

圖1 對照品溶液波長掃描圖

圖2 供試品溶液波長掃描圖

2.3.5 線性關系考察 分別精密吸取對照品溶液0μL、50μL、100μL、200μL、300μL、400μL、500μL，置 10 m L量瓶中，加水至3 m L；精密加入5%苯酚溶液1 m L，搖勻；精密吸取硫酸5 m L迅速加入，振搖。冷卻后于沸水中加熱15分鐘，取出后冷卻，加水至刻度，搖勻。以相應的試劑為空白，在490 nm波長處測定吸光度。葡萄糖濃度 C分別為 0.005 2、0.010 4、0.020 8、0.031 2、0.041 6、0.052 0 mg/m L，其吸光度A值分別為0.110、0.180、0.324、0.439、0.590和0.699，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程：A＝12.784 C＋0.049 8，r＝0.999 1。結果表明：葡萄糖濃度在0.005 2～0.052 0 mg/mL范圍內，吸光度與濃度具有良好的線性關系。

2.3.6 精密度試驗 精密吸取對照品溶液連續測定6次，結果吸光度A的RSD為0.26%，表明實驗儀器精密度良好。

2.3.7 穩定性試驗 將供試品溶液，依法顯色后，每隔0.5小時測定吸光度A一次，連續測定6次。結果A值的RSD為0.67%，表明顯色后的樣品溶液在3小時內穩定性良好。

2.3.8 重復性試驗 精密稱取紅曲霉粗多糖6份，制成供試品溶液測定其含量，紅曲霉粗多糖中多糖的平均含量為63.81%，RSD為1.73%。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品6份，分別按樣品中多糖含量的80%、100%、120%比例加入葡萄糖對照品溶液，平行操作2份，再按供試品溶液制備方法制備6份，測定其吸光度，計算回收率，結果見表1。根據所得結果，表明本法具有良好的回收率。

2.3.10 樣品含量測定 取紅曲霉粗多糖樣品5份，按照2.3.3項操作配制，精密吸取樣品溶液0.2 m L，按照2.3.5項配制樣品溶液，測定吸光度A值，計算出紅曲霉粗多糖中多糖的平均含量，結果見表2。

表1 加樣回收率試驗結果

表2 樣品含量測定結果

3 結論

3.1 本實驗采用超聲波破碎菌體細胞和浸提相結合的方式，從而提高紅曲霉粗多糖的提取率，實驗表明本提取方法效果良好。

3.2 制備多糖時常用Sevage法去蛋白，但此方法比較溫和，去蛋白率不高，常需多次操作，本實驗采用三氯乙酸法去蛋白質，去蛋白率高，但是三氯乙酸酸性強，需在低溫下操作，以防止多糖降解。

3.3 多糖的測定方法有多種，本實驗采用多次水提醇沉的方法得到紅曲霉粗多糖，并通過苯酚-硫酸法顯色，在490nm最大吸收波長處測定其含量，結果具有準確可靠，重現性好，簡便快速等優點，可作為紅曲霉多糖含量的測定方法。

[1] 紀遠中.紅曲及紅曲霉的研究現狀及進展 [J].天津藥學，2005，17（2）：65-67.

[2] 趙東，胡曉龍，彭志云，等.淺談紅曲霉在白酒中的應用[J].釀酒，2010，37（2）：11-13.

[3] 張建峰，昌友權，陳光，等.紅曲多糖的免疫活性研究[J].食品科學，2008，29（2）：391-393.

[4] 郭小群.苯酚-硫酸顯色法測定多糖[J].廣東化工，2010，37（5）：207.