宮頸癌組織中法尼基轉(zhuǎn)移酶 β-亞單位基因的表達(dá)變化及意義

朱英宏,羅 兵

(1萊蕪市人民醫(yī)院,山東萊蕪 271100;2青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女健康的惡性腫瘤,病死率居女性癌癥病死率的第 2位。法尼基轉(zhuǎn)移酶(FTase)是一種位于細(xì)胞溶質(zhì)中的酶,廣泛分布于哺乳動物細(xì)胞、酵母及卵蛙細(xì)胞中,催化細(xì)胞多肽翻譯后修飾的第一步驟,即法尼基化。其底物包括Ras蛋白、核纖層蛋白、視紫紅質(zhì)激酶、磷酰化酶激酶等[1]。FTaseβ亞單位可結(jié)合Ras蛋白[2]。Ras蛋白的生物活性與法尼基化修飾有密切關(guān)系。2005年9月～2008年7月,我們采用RT-PCR技術(shù)檢測了宮頸癌組織中的FTaseβ亞單位mRNA,探討其在宮頸癌診斷和預(yù)后判斷中的作用和價(jià)值,為FTase抑制劑用于宮頸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 宮頸癌 45例,年齡 27～72歲,平均42.5歲;其中TNM分期Ⅰ期23例,Ⅱ期22例;中分化 26例,低分化 19例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 9例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 36例。均行腫瘤切除術(shù),留取癌組織標(biāo)本;均經(jīng)病理學(xué)確診,術(shù)前均未行放療、化療或激素治療。同時(shí),選取 20例同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)后的正常子宮頸組織作為對照。

1.2 FTaseβ亞單位mRNA檢測方法 采用RTPCR法。先用Trizol試劑提取癌組織總RNA,每例取總RNA 2μl,用AMV反轉(zhuǎn)錄酶行反轉(zhuǎn)錄;以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA作為PCR反應(yīng)的模板,擴(kuò)增FTaseβ亞單位基因和內(nèi)參照GADPH基因。FTaseβ亞單位mRNA引物參照文獻(xiàn)[3]設(shè)計(jì),由上海生工合成。PCR反應(yīng)體積為25μl,包括FTaseβ亞單位mRNA和內(nèi)參照基因GAPDH上下游引物均0.3μmol/L, Taq DNA聚合酶1.0 U,cDNA模板2μl,加雙蒸水至終體積25μl。PCR擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min;然后94℃40 s,56℃40 s,72℃1min,共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后 72℃延伸10 min。結(jié)果判定:取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5μl于含溴化乙錠(0.5 mg/L)的2%瓊脂糖凝膠中電泳,80 V 1 h,紫外投射儀下觀察結(jié)果并拍照,與DNA分子量Marker對照相比,出現(xiàn)316 bp和450 bp擴(kuò)增條帶表明擴(kuò)增成功。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對FTaseβ亞單位mRNA的表達(dá)進(jìn)行半定量分析,以FTaseβ亞單位與GAPDH的比值表示目的基因的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件。數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)及方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

宮頸癌組織中FTaseβ亞單位mRNA表達(dá)水平為1.065 8±0.630 8,正常宮頸組織中為0.763 2± 0.190 9,兩者比較,P＜0.05;FTaseβ亞單位mRNA表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表 1。由表1可見,FTaseβ亞單位mRNA表達(dá)水平與宮頸癌分化程度有關(guān)(P＜0.05)。

3 討論

宮頸癌的病因至今尚未完全明了。一般認(rèn)為,宮頸癌發(fā)病與早婚、性生活紊亂、性生活過早、早年分娩、密產(chǎn)、多產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)狀況、種族和地理環(huán)境等因素有關(guān),病毒感染也是宮頸癌發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。研究表明,約30%的人類腫瘤存在Ras基因突變、Ras蛋白表達(dá)水平增高的現(xiàn)象。FTase是近年來發(fā)現(xiàn)的與Ras蛋白異戊二烯化修飾密切相關(guān)的一種必需酶。抑制FTase的活性,可以阻止Ras蛋白法尼基化,有效的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。近年來,Ras蛋白、FTase與女性生殖系統(tǒng)腫瘤關(guān)系的研究也取得了一定進(jìn)展。

表1 FTaseβ亞單位mRNA表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Ras蛋白合成后,需經(jīng)一系列加工修飾方可定位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè),進(jìn)而實(shí)行其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,法尼基化是 Ras蛋白脂化修飾的最關(guān)鍵步驟之一[4.5]。FTase可將膽固醇合成途徑中的中間體法尼基焦磷酸(FDP)的法尼基轉(zhuǎn)移到Ras蛋白C-末端的半胱氨酸上,Ras蛋白首先在細(xì)胞質(zhì)的游離核糖體中合成前體蛋白(pro-p21),經(jīng)過一系列翻譯后的C端修飾,增強(qiáng)了蛋白的疏水性使之定位于質(zhì)膜的內(nèi)表面。FTase是由 α、β兩種亞單位組成的異二聚體,β-亞單位識別底物序列,結(jié)合Ras蛋白;α-亞單位是其底物法尼基二磷酸鹽FPP的攜帶者,FTase的酶催化功能必須由 α、β亞單位共同完成,任何一個(gè)亞單位的變性都會影響酶活性。

FTase通過催化Ras蛋白法尼基化,由Ras蛋白作為信號傳導(dǎo)開關(guān)引起一系列細(xì)胞信號傳導(dǎo);為探討FTase是否直接參與細(xì)胞增殖,Nagase等[6]采用DNA重組技術(shù)將FTaseα和FTaseβ亞單位編碼基因同時(shí)轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞,對FTase過表達(dá)細(xì)胞中Ras蛋白的法尼基化以及Ras信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的上下游因子活性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈FTase過表達(dá),α、β亞單位蛋白表達(dá)較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞提高3～13倍,FTase活性提高1.5～3倍,法尼基化Ras蛋白表達(dá)增加。Nagase等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),合適劑量的生長因子能明顯提高FTase過表達(dá)細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞增殖。Nagase將FTase過表達(dá)細(xì)胞注入無胸腺裸鼠可導(dǎo)致腫瘤形成,但該類腫瘤與將Ras過表達(dá)細(xì)胞注入裸鼠形成的腫瘤表型明顯不同,提示FTase直接參與細(xì)胞生長轉(zhuǎn)化以及腫瘤形成機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示,宮頸癌組織中FTaseβ亞單位mRNA明顯高于正常宮頸組織,且其表達(dá)水平與宮頸癌分化程度明顯相關(guān),我們認(rèn)為FTase可能直接參與宮頸細(xì)胞的癌變過程,其水平可作為宮頸癌診斷和預(yù)后判斷的重要指標(biāo)。

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