低劑量伽瑪刀照射治療對功能區癲癇動物行為及其皮層神經元顯微結構的影響

董長征,李文玲,趙文清,岳向勇,郭 韜,康進生

(河北省人民醫院,石家莊 050051)

迄今為止,低劑量伽瑪刀照射治療功能區癲癇的機制尚未完全闡明[1],近年研究證實,腦神經元凋亡與癲癇發病機制密切相關[2]。貓腦額葉乙狀前回是貓的運動功能區中樞。2007年 5月 ～2007年 8月,我們觀察了低劑量伽瑪刀照射對功能區癲癇貓模型行為及腦額葉功能區皮層神經元顯微結構的影響,探討低劑量伽瑪刀照射抗癲癇發作的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 健康成年貓 80只,均為雄性,體質量2.5～3.5 kg;注射用青霉素,異丙酚(200 mg/支);Signa 1.5 T核磁共振儀,LEKSELL B型伽瑪刀,生物信號定量記錄分析系統(MS4000U-1型)。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將 80只貓隨機分成正常對照組(A組)、癲癇模型組(B組)、伽瑪刀治療組(C組)。A組24只不做任何處理;B、C組各28只,均用貓額功能區皮質多次注射青霉素法制作點燃癲癇模型[3],凡顯示連續出現 5次Ⅲ級以上驚厥為達到點燃標準。C組造模成功后給予伽瑪刀照射治療。

1.2.2 照射方法 C組動物用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉,將其頭部安裝于Leksell立體定向頭架;用MRI行無間隔定位掃描,層厚2 mm;掃描圖像經計算機網絡傳至Gamma Plan系統制定治療計劃,確定照射靶區位于右側額葉的X-Y-Z坐標。將固定貓腦的Leksell框架按所定坐標安放在伽瑪刀定位架上,用 4mm準直器,對靶區腦組織實施照射,邊緣劑量為15Gy。

1.2.3 行為學觀察方法 采用Smialowki 6級評分法[4]貓行為學變化。于伽瑪刀照射后 4、8、12周,A組取6只,B、C組各 10只再次給予腦額葉皮層青霉素注射,觀察實驗動物的發作級別,以出現Ⅳ ～Ⅵ級發作為重度發作,僅出現Ⅲ級或Ⅲ級以下為輕度發作。

1.2.4 腦額葉功能區皮層神經顯微結構觀察及神經元數目測定 于伽瑪刀照射后 4、8、12周,各組取18只,用3%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。開胸后,經左心室至升主動脈插管,用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4)500 ml行灌流固定。開顱取出照射靶區腦組織,置于4%多聚甲醛后固定6 h;入200 g/L蔗糖溶液,4℃過夜;冰凍切片機做皮層垂直斷面冰凍切片,片厚 14μm。采用蘇木精—伊紅染色,光鏡下觀察各組動物不同時相腦額葉功能區皮層神經顯微結構變化,并計數神經元數目。應用Leica Qwin圖像分析軟件,每張切片取 5個 400倍視野,測定每個視野的神經元個數,然后計算平均細胞數。

1.2.5 統計學方法 采用SAS8.0軟件。實驗數據采用±s表示,組間比較采用方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組行為學觀察結果比較 A組各時點均未出現癇性發作,B組造模成功后 4、8、12周重度發作率分別為90%、80%、80%,而C組重度發作率分別為70%、60%、30%。在12周時,C組與 B組比較, P＜0.05。

2.2 各組腦額葉功能區皮層神經元數目及顯微形態結構改變 A組大腦額葉皮層神經元邊界清晰,細胞核呈圓形、橢圓形,染色質在核內分布較均勻,核仁清晰。從第 8周開始,B組細胞結構出現明顯異常,殘存神經元胞核、胞質深染,邊緣不清,胞核內染色質凝聚成塊狀、邊集,甚至核固縮;部分細胞胞質溶解,出現空泡狀結構,有的整個神經元呈濃縮狀態,體積縮小;可見紅色神經元、噬神經現象及衛星現象。C組神經元細胞核大而圓且染色淺,神經細胞內空泡減少,胞質增多,未見核固縮及核溶解現象。各組腦額葉功能區皮層神經元數目比較,見表 1。

表1 各組不同時相貓腦額葉功能區皮層神經元數目比較(個,±s)

表1 各組不同時相貓腦額葉功能區皮層神經元數目比較(個,±s)

注:與A組比較,＊P＜0.05;與B組比較,#P＜0.05

組別 n 4周 8周 12周A組 18 275±56 270±37 271±15 B組 18 231±39 196±14＊ 174±57＊C組 18 246±24 251±48 264±76#

3 討論

既往研究證實,長期反復癲癇發作可導致包括腦神經元凋亡在內的神經元的死亡,人和動物癲癇病灶中也存在神經元數目減少現象[5,6]。目前,關于伽瑪刀治療功能區癲癇的機制尚不十分清楚。推測可能是由于低劑量的伽瑪射線導致癲癇神經元持續的、非破壞性的結構性改變,即神經元的可塑性發生變化[7～10],包括:①癲癇神經元突觸結構變化;②癲癇神經元的活性降低,如興奮性氨基酸濃度減少;③癲癇神經元的傳導阻滯,如電鏡下發現神經元突觸缺失;④癲癇神經元的直接破壞(放射性壞死)。

本研究在成功建立青霉素慢性點燃癲癇動物模型的基礎上,從結構形態學改變來探討伽瑪刀治療功能區癲癇的效果及作用機制。結果在照射后 12周時,伽瑪刀照射組發作級別較模型組明顯減輕,且試驗動物無明顯肢體活動障礙。這表明低劑量伽瑪刀照射可以降低動物的發作級別,對功能區癲癇發作起到抑制作用,而且不產生明顯的神經功能缺失。本研究結果顯示,通過青霉素慢性點燃癲癇模型后,觀察到癲癇模型組貓腦額葉功能區皮層神經元數目明顯減少,且有的整個神經元呈濃縮狀態,甚至出現核固縮,說明慢性癲癇動物模型的腦功能區皮層神經元數目減少,且出現典型的凋亡神經元的形態特征;而且,神經元隨時間延長可見到細胞損傷呈進行性加重。而伽瑪刀治療組,每個時間點神經元結構損傷均減輕,凋亡細胞減少,整個細胞溶解及空化現象減輕,細胞輕度腫脹。這表明癲癇發作時間越久,損傷越重,說明腦功能區皮層結構損傷與長時間抽搐發作引起的缺氧、缺血性變化有一定的關系。低劑量伽瑪刀照射能夠較好地抑制慢性癲癇模型中腦皮層神經元數目的減少及神經元凋亡,可能與伽瑪刀照射后發作停止或減少,從而減少發作帶來的腦的缺氧、缺血所致的細胞凋亡有關。這可能是伽瑪刀治療功能區癲癇的另一重要機制,其他的作用機制還有待進一步研究。

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