懸浮培養(yǎng)技術在生物制藥中的應用和展望

張 韌，秦玉明，陳文慶，劉華杰，王建超，高 飛

(1.北京清大天一科技有限公司，北京 102200;2.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

目前，國內生物疫苗生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)細胞培養(yǎng)的抗原時，普遍采用傳統(tǒng)的轉瓶細胞培養(yǎng)工藝，該方法存在細胞密度低、病毒產(chǎn)率低、生產(chǎn)成本高、勞動強度大等缺點。誕生于20世紀60年代的懸浮培養(yǎng)技術可以進行大規(guī)模細胞培養(yǎng)，能夠獲得大量的病毒產(chǎn)物和高質量的疫苗產(chǎn)品，在國外疫苗生產(chǎn)中普遍應用。懸浮培養(yǎng)技術是在生物反應器中、人工條件下高密度大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞用于生物制品生產(chǎn)的技術，根據(jù)細胞是否貼壁，分為懸浮細胞培養(yǎng)和貼壁細胞微載體懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)技術最大優(yōu)勢是通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質量。

1 懸浮培養(yǎng)技術在生物制藥中的應用歷史和現(xiàn)狀

1962年，Capstick等對BHK21細胞馴化實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)［1］，并用于獸用疫苗生產(chǎn)［2］。1967 年，Van Wezel開發(fā)了微載體［3］并實現(xiàn)在生物反應器中大規(guī)模培養(yǎng)貼壁細胞。懸浮培養(yǎng)與微載體培養(yǎng)標志著細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術的開始，細胞生產(chǎn)病毒疫苗也成為細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術生產(chǎn)生物制品的第一次浪潮。20世紀80年代后，CHO細胞實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，治療性抗體生產(chǎn)技術的發(fā)展極大地推動著生物反應器在生物制藥行業(yè)中的應用，到20世紀末已進入萬升級規(guī)模［4］。2000年以后，隨著流加培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)、個性化細胞培養(yǎng)基等技術的發(fā)展，作為大規(guī)模培養(yǎng)主要設備的生物反應器規(guī)模也趨向大型化和簡單化。現(xiàn)在，全球10000 L及以上體積的反應器達一百多臺，最大已達25000 L，且?guī)缀醵际强梢苑糯蟮臋C械攪拌式反應器，主要為Genetech、Amgen、Boehringer Ingelheim 和 Lonza 等公司所擁有［5］。當前生物制藥的主流技術是在大型機械攪拌式反應器中，用無血清培養(yǎng)基和流加培養(yǎng)工藝懸浮培養(yǎng)細胞進行生產(chǎn)［6］。

動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)生物制品的應用領域在快速發(fā)展。2007年全球銷售額最高的6大類生物技術藥物中，有5類是經(jīng)哺乳動物細胞表達生產(chǎn)的［7］。現(xiàn)代基因工程技術及個性化培養(yǎng)基技術的發(fā)展，促進細胞培養(yǎng)制藥的快速進展，例如開發(fā)出MDCK細胞在反應器中懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗以代替?zhèn)鹘y(tǒng)的雞胚生產(chǎn)，10 L密度為106個/mL的細胞產(chǎn)能相當于10000只雞胚的產(chǎn)量［8］。國際知名廠家紛紛進行細胞改造篩選，發(fā)展自己的細胞培養(yǎng)平臺進行流感疫苗的生產(chǎn)，包括Baxter公司的Vero細胞平臺、Crucell公司和賽諾菲巴斯德的PER－C6細胞平臺、諾華公司的MDCK細胞平臺等［9］。

縱觀國內，人用和獸用疫苗生產(chǎn)企業(yè)已超過110家，應用反應器懸浮培養(yǎng)技術生產(chǎn)疫苗的僅4家。生產(chǎn)人用疫苗的企業(yè)有3家，規(guī)模是數(shù)十臺14～30 L進口反應器;一般獸用疫苗企業(yè)采用國內自主開發(fā)的650 L和1200 L反應器生產(chǎn)口蹄疫疫苗［10］。在治療性抗體生產(chǎn)方面，有2家企業(yè)采用進口1000～3000 L生物反應器生產(chǎn)，但與國外萬升級規(guī)模相比還有較大的差距。

我國“七五”至“八五”攻關期間立項研發(fā)動物細胞生物反應器，但由于細胞培養(yǎng)技術要求高、壁壘大，研發(fā)單位在未掌握核心技術的情況下，僅憑模仿很難實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，國產(chǎn)細胞生物反應器在2008年以前幾乎是空白;由于細胞株等上游配套技術落后、缺乏個性化細胞培養(yǎng)基支持以及生化工程研究等原因，細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術一直難以突破技術瓶頸［11］。《中國生物技術產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告(2005)》指出:自主綜合支撐技術是大規(guī)模懸浮培養(yǎng)技術在我國實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化最難以跨越的技術“門檻”。

2 懸浮培養(yǎng)工藝中的關鍵技術

生物制品生產(chǎn)過程研發(fā)的兩個主要目的是提高產(chǎn)率、保證產(chǎn)物的質量和過程工藝設計的一致性，前者直接關系到商業(yè)化生產(chǎn)的可行性，后者則關系到藥物的安全和有效性。對應懸浮培養(yǎng)技術主要包括高表達細胞株的獲得、個性化培養(yǎng)基的研發(fā)、動物細胞反應器及配套設施的完善及生產(chǎn)工藝的優(yōu)化等四個方面。

2.1 細胞與毒株的馴化與保藏 為提高生物制品的產(chǎn)率和安全有效性，在生物反應器中繁殖的病毒與細胞需要進行相互適應選擇，針對不同的毒株及其表達量篩選適合的宿主細胞對于細胞大規(guī)模生產(chǎn)具有重要意義。

2.1.1 細胞的篩選馴化和保藏 實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)首先需要選擇合適的宿主細胞，細胞系的特征直接影響放大的可能性以及放大技術的選擇。同一種細胞在懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)時對同一病毒的敏感性不同;同一株細胞不同的克隆對營養(yǎng)條件有不同的需求，對病毒敏感性亦可能不同。

通常根據(jù)毒株特性，綜合考慮所用毒株能在何種細胞上增殖、表達，懸浮或貼壁細胞屬性是否適合大規(guī)模培養(yǎng)，規(guī)模和技術是否影響表達的穩(wěn)定性，能否進行馴化，馴化后毒株的敏感性和表達量是否有變化等因素選擇合適的宿主細胞。細胞和毒株的篩選馴化非常重要，尤其對于貼壁細胞，因微載體懸浮培養(yǎng)比全懸浮培養(yǎng)成本高，所以一些國際知名企業(yè)對Vero細胞、MDCK細胞及PER－C6細胞進行懸浮化［8－9］培養(yǎng)并已獲成功。

細胞篩選馴化的實質是應用現(xiàn)代細胞生物學技術，在降低細胞凋亡率、提高細胞活力、延長細胞生命周期、提高產(chǎn)物濃度等方面進行研究，結合特定細胞的營養(yǎng)需求進行培養(yǎng)基優(yōu)化，篩選適用于生產(chǎn)的細胞株。Lonza公司在2005年采用普通CHOK1細胞株和轉染克隆篩選后的懸浮突變細胞株CHOK1SV進行蛋白表達能力對比，發(fā)現(xiàn)篩選后的細胞蛋白表達能力提高了4～5倍［5］。Chia chu等也通過轉染技術克隆篩選出懸浮的MDCK細胞株［8］。

為實現(xiàn)馴化的穩(wěn)定，通常由高密度細胞培養(yǎng)轉向低密度細胞培養(yǎng)，由高濃度血清培養(yǎng)逐漸降低血清濃度進行培養(yǎng)。因細胞損傷后難以修復，所以馴化時細胞活力應保持在90%以上。細胞的增殖能力直接影響產(chǎn)能，馴化時應保持對其增殖能力的測定。細胞馴化時還應對其表達分泌能力進行測定，避免馴化后的細胞表達特性發(fā)生變化。馴化后細胞的增殖能力、活力及生產(chǎn)能力要能夠滿足工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。由于特定細胞的營養(yǎng)需求不同，實現(xiàn)其馴化的難易程度也不同，在馴化時需要選用合適的細胞培養(yǎng)基，有針對性地補充某些營養(yǎng)成分以滿足細胞的特定需求，使馴化好的細胞可以保持其懸浮或是無血清生長的特性。與20世紀80年代相比，由于細胞培養(yǎng)基技術的發(fā)展，細胞馴化變得相對容易。

在篩選馴化過程中應注意及時對細胞進行保藏，以避免在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)異常情況導致篩選馴化工作量的重復和時間浪費。保藏時，應選用在該馴化條件下細胞狀態(tài)良好的細胞。

2.1.2 病毒對細胞的敏感性關系 培養(yǎng)動物細胞的目的是通過細胞制備足夠量的病毒，因此，毒株對細胞的敏感性非常重要。但在實際應用中，毒株對細胞的敏感性、差異性較大。不同細胞對同一病毒敏感性不同，同一細胞對不同病毒株敏感性不同;懸浮細胞和貼壁細胞的敏感性不同;同一病毒株可在多種宿主細胞上生長，一種細胞系平臺也可能生產(chǎn)多種病毒;同一細胞不同培養(yǎng)方式的病毒量、抗原結構、免疫原性、毒力等也可能不同。如狂犬病毒PM毒株從最初的兔脊髓制備，經(jīng)過多種(次)細胞適應和傳代，發(fā)展到現(xiàn)在采用Vero細胞制備，使狂犬病疫苗的生產(chǎn)率明顯提高;而狂犬病毒Flury LEP株也從最初的雞胚成纖維細胞生產(chǎn)發(fā)展到BHK21細胞生產(chǎn)，并進一步適應了反應器懸浮培養(yǎng)等［12］。

當病毒對一些細胞基質不夠敏感時，可以通過傳代馴化的方式，使病毒逐步適應該細胞基質，最終滿足生產(chǎn)疫苗的需求。

在優(yōu)化培養(yǎng)工藝的基礎上，作為種源的毒株及相應細胞株的篩選優(yōu)化，提高細胞培養(yǎng)的質量和病毒表達量已是當前提高產(chǎn)率的一個技術要點，也是降低成本、提高生產(chǎn)競爭力的關鍵之一。諾華公司采用來自于ATCC的血清依賴型MDCK細胞株進行馴化篩選，形成了在無血清無蛋白條件下懸浮培養(yǎng)的流感病毒專用MDCK細胞株［9］。

2.2 細胞培養(yǎng)基的個性化和優(yōu)化 瑞士聯(lián)邦科技學會生物工藝學教授Wurm博士在2005年即指出:“培養(yǎng)基雖不是細胞培養(yǎng)中唯一重要因素，但確是最重要的一種”［13］。尤其在大規(guī)模培養(yǎng)技術中，維持細胞高密度甚至無血清生長，細胞培養(yǎng)基的營養(yǎng)含量對細胞的增殖、維持至關重要。在懸浮培養(yǎng)技術中，不同細胞營養(yǎng)代謝的特異性不同，細胞和病毒培養(yǎng)工藝不同，需要抗剪切力、滿足放大功能，還需要提高目標生物制品的穩(wěn)定性、表達量，這些均需要個性化培養(yǎng)基的支持。Lonza公司2005年研究結果表明，采用優(yōu)化后的限定化學成分細胞培養(yǎng)基與目錄細胞培養(yǎng)基相比，蛋白表達量提高了9.6倍［6，14］。

個性化細胞培養(yǎng)基在國外生物制品生產(chǎn)中被普遍采用，生物制藥公司往往與細胞培養(yǎng)基企業(yè)建立合同服務關系，研制最適合的個性化細胞培養(yǎng)基用于生產(chǎn)，由細胞培養(yǎng)基企業(yè)為用戶提供細胞培養(yǎng)基定制以及相關技術支持，幫助他們最大程度地提高生產(chǎn)效率［15］。為用戶定制細胞培養(yǎng)基是世界幾大細胞培養(yǎng)基制造商業(yè)務的主要部分，而公開的目錄細胞培養(yǎng)基產(chǎn)品僅占其業(yè)務的10% ～30%［16］。

但是我國銷售的細胞培養(yǎng)基卻多為20世紀50年代發(fā)明的MEM、DMEM、199、RPMI1640細胞培養(yǎng)基等［15］，這些目錄產(chǎn)品難以滿足生物反應器大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的技術要求，直接影響了生物制藥行業(yè)技術升級。

細胞培養(yǎng)基經(jīng)過天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基，發(fā)展到無血清培養(yǎng)基、無蛋白培養(yǎng)基、限定化學成分培養(yǎng)基，近百年的發(fā)展，已發(fā)生質的飛躍。無血清培養(yǎng)基杜絕了血清的外源性污染和對細胞毒性作用，使產(chǎn)品易于純化、回收率高;其成分明確，有利于研究細胞的生理調節(jié)機制;還可根據(jù)不同細胞株設計和優(yōu)化適合其高密度生長或高水平表達的培養(yǎng)基［17］。從對人類和動物安全性的長遠考慮，生物制品生產(chǎn)越來越傾向采用無血清無動物組分培養(yǎng)基，國際上生物制藥生產(chǎn)中，已經(jīng)有50%以上采用無血清細胞培養(yǎng)基［18］。

2.3 細胞培養(yǎng)工藝的研發(fā) 懸浮培養(yǎng)過程技術的開發(fā)和應用主要是生產(chǎn)工藝的開發(fā)和工藝過程優(yōu)化，維持細胞生長和病毒繁殖的最優(yōu)化環(huán)境控制，在懸浮培養(yǎng)技術中的作用同樣至關重要。

2.3.1 懸浮培養(yǎng)和微載體培養(yǎng)工藝 懸浮培養(yǎng)技術按細胞貼壁性分為懸浮細胞培養(yǎng)工藝和貼壁細胞微載體懸浮培養(yǎng)工藝。懸浮細胞(CHO細胞、BHK21細胞等)可以在反應器中直接生產(chǎn)增殖，細胞自由生長、培養(yǎng)環(huán)境均一、取樣簡單、培養(yǎng)操作簡單可控、放大方便、污染率和成本低;而貼壁細胞在反應器中懸浮培養(yǎng)需要借助微載體，細胞和球體接觸部位營養(yǎng)環(huán)境較差，培養(yǎng)、取樣觀察及放大工藝復雜，成本高。

雖然相對于懸浮培養(yǎng)，微載體培養(yǎng)工藝復雜，但與轉瓶培養(yǎng)相比仍有很大優(yōu)勢，能提高生產(chǎn)規(guī)模、產(chǎn)品質量和勞動效率，因此是貼壁細胞懸浮培養(yǎng)的主要手段。巴斯德公司利用1000 L反應器微載體培養(yǎng)Vero細胞生產(chǎn)人用狂犬病疫苗和脊髓灰質炎疫苗，Baxter公司微載體培養(yǎng)細胞工藝已達6000 L規(guī)模。

微載體對細胞附著、細胞的進一步擴展和重組蛋白的表達有較大影響。常見的微載體有實體的Cytodex微載體、片狀的 DISK微載體及多孔的Cytopore微載體。使用DISK或Cytopore時細胞貼附于載體內部生長，表面細胞較少，難以使用細胞消化等方法將載體和細胞進行分離，且反應器放大工藝困難，不適合非釋放病毒的培養(yǎng)。而Cytodex比較適應罐倒罐的反應器放大工藝，目前報道的貼壁細胞生產(chǎn)工藝的最佳形式是機械攪拌式反應器實體微載體懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)，可實現(xiàn)最有效的優(yōu)化工藝和最適宜的工藝設計，其最佳工藝設計體現(xiàn)于高密度連續(xù)灌流培養(yǎng)［15］。清大天一公司在微載體懸浮培養(yǎng)Vero細胞、MARC145細胞和ST細胞等工藝技術方面同樣取得了較好的進展。

2.3.2 懸浮培養(yǎng)工藝及選擇 細胞懸浮培養(yǎng)工藝按照培養(yǎng)方式分為批培養(yǎng)、流加培養(yǎng)及灌注培養(yǎng)。批培養(yǎng)能直觀反映細胞在生物反應器中的生長、代謝變化，操作簡單，但初期代謝廢產(chǎn)物較多，抑制細胞生長，細胞生長密度不高;流加培養(yǎng)操作簡單、產(chǎn)率高、容易放大，應用廣泛，但需要進行流加培養(yǎng)基的設計;灌注培養(yǎng)的培養(yǎng)體積小，回收體積大，產(chǎn)品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，利于保持產(chǎn)品的活性，但操作比較繁雜、細胞培養(yǎng)基利用效率低、旋轉過濾器容易堵塞等。

不同的病毒采用的培養(yǎng)方式不同，如對于分泌型且產(chǎn)品活性降低較快的生物制品，宜采用灌注培養(yǎng)，且灌注培養(yǎng)也更適宜于微載體培養(yǎng)。同一生物制品由于其營養(yǎng)環(huán)境的不同，其生產(chǎn)工藝也可能發(fā)生變化，如BHK21細胞生產(chǎn)口蹄疫病毒，低血清培養(yǎng)時采用批培養(yǎng)，接毒前需要更換無血清的維持液;而無血清培養(yǎng)過程中無需換液，配合流加培養(yǎng)可能效果更好。選擇反應器懸浮培養(yǎng)工藝需要考慮細胞和病毒的關系、產(chǎn)物穩(wěn)定性、細胞培養(yǎng)基或添加物的選擇、細胞培養(yǎng)規(guī)模等幾個因素。

2.3.3 懸浮培養(yǎng)過程參數(shù)控制 選定合適的生產(chǎn)工藝后，過程控制成為關鍵。為確保細胞生長在最優(yōu)環(huán)境中，需要利用反應器的在線監(jiān)控功能控制各種運行參數(shù)［6］。

細胞對溫度較敏感，需要采用合適的加熱或冷卻方式控制培養(yǎng)溫度在35℃ ～37℃，避免細胞受到損傷。動物細胞生長適宜的pH范圍一般在6.8～7.3之間，低于6.8或高于7.3都可能會對細胞生長產(chǎn)生不利的影響。Lonza公司針對CHO細胞在pH值分別為7.0和7.3條件下進行培養(yǎng)，結果表明，pH 7.0時細胞密度是pH 7.3的近2倍，生產(chǎn)率是其2.5倍［19］。因此在培養(yǎng)過程中，合適的pH控制對于整體產(chǎn)率具有較大的影響。溶氧濃度控制同樣重要，其需求范圍通常為20% ～60%的空氣飽和度，在控制溶氧的過程中，應注意通氣量，避免氣泡的破裂對細胞的損傷;同時通氣量會影響pH值，需要綜合考慮。在培養(yǎng)過程中還需要控制細胞培養(yǎng)液的滲透壓，大多數(shù)動物細胞的適宜滲透壓范圍是280～320 mOsm/kg H2O左右，在使用碳酸鈉或碳酸氫鈉來控制pH值的同時，需檢測滲透壓是否在正常范圍之內。

此外，還要進行流加方式、灌流速率及代謝的控制等。在整個過程控制中，各個參數(shù)不是單一運行，且相互影響，需要進行全面控制。

2.4 生物反應器的選擇 反應器規(guī)模能否放大是選擇反應器的一個重要前提，懸浮培養(yǎng)規(guī)模的放大主要通過增加反應器體積或者增加反應器數(shù)量，增大反應器體積可以節(jié)省大量的配套工程及人員成本，而多臺小的反應器雖然操作靈活［20］，但成本相對高。在國外生物制品生產(chǎn)中采用的多是較大規(guī)模的、能夠逐級放大的生物反應器。

選擇和配置生物反應器還需考慮和滿足生產(chǎn)工藝和產(chǎn)能需求。反應器接口的標準化、配件提供速度及售后服務質量等，均應作為工業(yè)化選用生物反應器考慮的因素，以免造成生產(chǎn)的延誤。

3 國內懸浮培養(yǎng)技術產(chǎn)業(yè)化存在的挑戰(zhàn)和展望

3.1 國內懸浮培養(yǎng)技術產(chǎn)業(yè)化的挑戰(zhàn) 國際上反應器懸浮培養(yǎng)技術已廣泛用于生物制藥生產(chǎn)，且在高表達細胞株的構建、個性化培養(yǎng)基的研發(fā)等方面不斷發(fā)展。大量新建反應器和產(chǎn)物表達量的提高已導致反應器容量過剩，發(fā)達國家市場出現(xiàn)飽和、向發(fā)展中國家擴展的趨勢。各大生物制藥巨頭開始通過合作或并購等方式進入新興的中國市場。制藥巨頭賽諾菲－安萬特看中中國兼具研發(fā)和新興市場這兩種特質，在藥品研發(fā)、生產(chǎn)包括動物疫苗等領域在中國進行了大量投資;諾華公司則在2009年底，通過收購中國第二大甲流疫苗供應商——浙江天元生物股權，快速進軍中國疫苗行業(yè)。

3.2 展望 應該認識到，快速實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術在疫苗生產(chǎn)中的應用只是搭建了一個升級的工藝平臺，而不是最終目的，行業(yè)和企業(yè)發(fā)展真正的動力是新藥、新疫苗、新工藝以及配套技術的創(chuàng)新。例如無血清培養(yǎng)病毒生產(chǎn)技術的開發(fā)，包括無血清培養(yǎng)基的開發(fā);利用合適的培養(yǎng)基和轉染或馴化技術實現(xiàn)貼壁細胞的懸浮培養(yǎng)構建;新宿主細胞表達品種開發(fā)，例如同一種產(chǎn)品采用新的宿主細胞表達或是開發(fā)一種高效表達的宿主細胞適應幾種產(chǎn)品的表達;利用基因工程技術，開發(fā)更安全的疫苗品種;生物制品相關的關鍵技術和產(chǎn)品國產(chǎn)化，例如個性化細胞培養(yǎng)基、生物反應器、微載體、純化裝置、佐劑等。

4 結語

整合行業(yè)力量，快速實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)技術在疫苗生產(chǎn)中的升級換代是未來幾年我國生物制藥行業(yè)發(fā)展的重點。這個過程應重視成熟技術、成功率，減少和避免時間、資金、人力等資源的浪費，減少機會成本，搶占市場先機。懸浮培養(yǎng)技術的升級將導致行業(yè)整合與重組，生物制藥行業(yè)將出現(xiàn)明顯的集約化趨勢，有實力的企業(yè)將不斷以創(chuàng)新新藥、新技術研發(fā)為基礎和核心競爭力，同時借助資金實力整合制造和營銷體系，成為真正意義上的龍頭。

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