化瘀瀉濁方對腎間質纖維化大鼠骨形態發生蛋白-7的影響

郭立芳 王月華 王鳳麗 李林林 袁國棟

(河北醫科大學中醫院，河北 石家莊 050011)

腎間質纖維化(RIF)是各種原因引起的慢性腎臟疾病進展為終末期腎衰的共同途徑〔1〕。其程度與腎功能的相關性比腎小球硬化與腎功能的相關性更為密切。骨形態發生蛋白(BMP)-7是一種內源性腎臟保護因子，具有抗纖維化作用，而這種保護作用可能與其拮抗轉化生長因子(TGF)-β1有關〔2〕。前期實驗研究證明化瘀瀉濁方具有減輕腎臟病理損害，減少纖維化面積，抑制腎組織 TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達的作用〔3〕。本研究以BMP-7為切入點，進一步探索本方對RIF發生發展的影響及其可能作用機制，為臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用健康、雌性SD大鼠50只，體質量(180±10)g，清潔級。由河北醫科大學動物實驗中心提供(動物合格證號:冀醫動管字第703058號)。

1.2 主要試劑及用藥 兔抗大鼠BMP-7單克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供。化瘀泄濁方由生黃芪30 g、生大黃 12 g、地龍 12 g、丹參 15 g、蒲公英 15 g、槐花 15 g、生牡蠣30 g、赤芍15 g等組成，由河北醫科大學中醫院藥房提供，上藥按比例稱取后，水煎、過濾、濃縮，裝入瓶中密封備用。纈沙坦由諾華公司提供(批號X0538)。

1.3 動物模型和分組 動物隨機分為假手術組、模型組、纈沙坦組、化瘀泄濁方組、阿魏酸哌嗪分散片組，每組10只。纈沙坦組予纈沙坦5.3 mg·kg－1·d－1經口灌服;化瘀泄濁方組予化瘀泄濁方5.7 g·kg－1·d－1經口灌服;阿魏酸哌嗪分散片組予阿魏酸哌嗪分散片6.7 mg·kg－1·d－1經口灌服;假手術組和模型組予同等量生理鹽水經口灌服。手術前1日開始給藥至實驗結束前1天。左側輸尿管結扎術按參照文獻〔3〕進行。除假手術組外其余各組均行左側輸尿管結扎術。于實驗第21日全部殺檢，取左側腎臟以4%多聚甲醛固定、包埋、切片，行HE及Masson染色進行病理學觀察，并采用免疫組化方法檢測BMP-7的表達。

1.4 免疫組織化學方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS-1000型全自動彩色病理圖像分析系統，在200倍光鏡下采集圖像，每例各選15個視野，計算一個視野中陽性細胞百分數，在光亮度和放大倍數一致的條件下對免疫組化結果進行自動測量，最后取平均值。

1.5 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件，進行One-Way ANOVA和組間LSD法。

2 結果

2.1 HE及Masson染色結果 腎組織HE及Masson染色顯示:模型組腎間質有大量炎細胞浸潤和纖維組織增生，腎小管部分萎縮、管腔閉塞或擴張，腎小球數目明顯減少，面積縮小。腎小囊粘連或擴張，小囊周圍大量纖維組織增生。其他各治療組間質可見多少不等的炎細胞浸潤，少量纖維組織增生，腎小管輕度擴張，部分腎小球輕度萎縮，小囊擴張，腎小球數量無明顯改變。

2.2 BMP-7蛋白的表達、分布及半定量分析結果 BMP-7主要表達于集合管和腎小管胞質中，在腎小球中未發現陽性表達。半定量分析顯示，在假手術組 BMP-7高表達(n=10，36.52% ±4.76%)，模型組(n=8，16.60% ±4.25%)及各治療組較假手術組顯著降低(P＜0.01);纈沙坦組(n=9，26.52% ±4.89%)、化瘀泄濁方組纈沙坦組(n=9，25.65% ±3.65%)、阿魏酸哌嗪分散片組(n=9，21.35% ±2.68%)與模型組相比，BMP-7的表達均呈顯著性增高(P＜0.01)，其中化瘀泄濁方組優于阿魏酸哌嗪分散片組(P＜0.01)，其他各組間均無明顯差異(P＞0.05)。

3 討論

目前中醫學認為，RIF病因病機有以下幾個方面。先天異常:腎為先天之本，稟賦于父母之精氣，若先天不足，腎精虧虛，則尿管及腎發育異常。濕熱蘊結:外邪入侵，郁而化熱，蘊結于腎與膀胱;或內熱下移，濕熱互結，膀胱氣化不利，水液內停。瘀血絡阻:久病多瘀，血不利則病水，瘀血阻滯，尿路不暢，水濕郁結于內;或瘀血內阻，氣滯血瘀，阻塞尿路。總之，本病是以濕熱、瘀血、絡阻等為基本病機，且相互轉化，相互影響。本實驗以化瘀泄濁中藥對單側輸尿管結扎誘導的RIF大鼠模型進行干預性治療，符合上述病機，具有可行性。方中丹參、赤芍、大黃、地龍活血通絡，化瘀泄濁;蒲公英、槐花清熱利濕，解毒泄濁;加用生牡蠣軟堅散結;生黃芪益氣，且黃芪益氣有走而不守之性，所以本品益氣不僅可以扶正固本，又可以助丹參、地龍等行血消瘀通絡祛邪治標。諸藥相伍通補并用、標本兼顧，故成為臨床用于延緩腎臟病發展進程的基礎方。

RIF是多種慢性腎臟疾病如慢性腎炎、慢性腎盂腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等發展到終末期腎衰的共同途徑。它以過量細胞外基質在腎間質積聚及腎間質成纖維細胞增生為特征。眾多細胞因子參與該過程，TGF-β1被公認為是最主要的促纖維化因子，是各種因子誘導小管上皮-肌成纖維細胞轉分化(EMT)的中心環節〔4，5〕。BMP-7 是 TGF-β 超家族中的一員，有20個以上的亞型，主要在腎、骨組織中表達，參與細胞內信號傳導、調節細胞增生、分化和凋亡、調控組織發育和形態維持。在本研究中應用化瘀泄濁中藥進行藥物干預治療，觀察其對RIF的防治作用。發現化瘀泄濁方組大鼠腎組織BMP-7蛋白較模型組顯著增高。且前期實驗研究也發現化瘀瀉濁方具有減少纖維化面積，抑制腎組織TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達作用〔3〕。體外研究也表明BMP-7能夠拮抗TGF-β1的致腎纖維化作用，其活性減低可能會促進腎纖維化的發生〔6，7〕。BMP-7是內源性抗腎臟纖維化的調節因子，作為正調節因素的對應物，起到制約腎臟纖維化的作用，BMP-7和TGF-β1的平衡對腎臟內環境的穩定起重要作用。由此我們認為BMP-7蛋白表達減少和TGF-β1、p-Smad2/3蛋白表達增多與腎小管間質纖維化密切相關，但其作用機制，有待深入研究。

1 張愛青，甘衛華，陳榮華，等.胰島素樣生長因子-Ⅰ對人腎小管上皮細胞轉分化及膠原合成的作用〔J〕.細胞與分子免疫學雜志，2007;23(2):127-9.

2 Wang S，Hirschberg R.BMP-7 antagonizes TGF-beta-dependent fibrogenesis in mesangial cells〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2003;284(5):1006-13.

3 潘利敏，王鳳麗，王彥凱，等.化瘀瀉濁方對腎間質纖維化實驗大鼠TGF-β1、p-Smad 2/3的影響〔J〕.中國中醫基礎醫學雜志，2010;16(9):775-6.

4 Forino M，Torregrossa R，Ceol M，et al.TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition，but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture〔J〕.Int J Exp Pathol，2006;87(3):197-208.

5 Roberts AB，Tian F，Byfield SD，et al.Smad3 is key to TGF-beta-mediated epithelial-to-mesenchymal transition，fibrosis，tumor suppression and metastasis〔J〕.Cytokine Growth Factor Rev，2006;17(1-2):19-27.

6 Zeisberg M，Kalluri R.Reversal of experimental renal fibrosis by BMP-7 provides insights into novel therapeutic strategies for chronic kidney disease〔J〕.Pediatr Nephrol，2008;23(9):1395-8.

7 Motazed R.BMP-7 and proximal tubule epithelial cells:activation of multiple signaling pathways reveals a novel anti-fibrotic mechanism〔J〕.Pharm Res，2008;25(10):2240-6.