帕金森病模型大鼠內(nèi)側(cè)前額葉皮層中間神經(jīng)元電活動的增強(qiáng)

王 爽 高 捷 蘇興利 郭玉芳 霍 健 王 湘

(西安醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，陜西 西安 710021)

哺乳動物腦干上行的單胺能神經(jīng)系統(tǒng)支配內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)并執(zhí)行許多重要的大腦高級功能。神經(jīng)解剖學(xué)證實(shí)腹側(cè)被蓋區(qū)(VTA)發(fā)出的DA能神經(jīng)纖維可以支配mPFC中γ-氨基丁酸(GABA)能中間神經(jīng)元的活動〔1〕。另外，mPFC還接受來源于中腦縫核(DRN和MRN)的5-羥色胺(5-HT)神經(jīng)纖維支配，而且，5-HT系統(tǒng)對于mPFC中神經(jīng)元的活動起重要的調(diào)節(jié)作用〔2〕。黑質(zhì)紋狀體通路的變性能夠?qū)е?-HT受體表達(dá)的異常，同樣在慢性帕金森綜合征的紋狀體、海馬和縫核中5-HT的含量顯著降低〔3〕。這些變化均有可能導(dǎo)致mPFC中GABA能神經(jīng)元性質(zhì)的改變。但是，PD情況下，mPFC中GABA能神經(jīng)元的電活動如何變化并不清楚。因此，本文將以PD模型大鼠為研究對象，采用神經(jīng)電生理學(xué)方法，研究在PD狀態(tài)下大鼠mPFC中GABA能中間神經(jīng)元的電活動改變。

1 材料與方法

1.1 動物和藥品 雄性SD大鼠25只，體重250～320 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。大鼠在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)，室溫20℃ ～25℃，24 h晝夜循環(huán)光照，自由攝食飲水。大鼠隨機(jī)分為2組:假手術(shù)組(n=9)和PD組(n=16)。實(shí)驗(yàn)所用6-羥基多巴胺(6-OHDA)購自美國Sigma公司。

1.2 電生理學(xué)記錄和放電形式的分析 電生理學(xué)記錄在SNc損毀術(shù)后第3周進(jìn)行。大鼠在4%水合氯醛(400 mg/kg，i.p.)麻醉下行氣管及靜脈插管術(shù)后，頭部固定于立體定位儀上，根據(jù)Paxinos-Watson大鼠腦定位圖譜，確定右側(cè)mPFC的坐標(biāo)位置:AP:2.7～3.2 mm;L:0.1～0.6 mm;D:1.5～2.5 mm。在冠狀面與中線成2°角處傾斜進(jìn)針，以避免損傷矢狀竇。采用玻璃微電極細(xì)胞外記錄法記錄中間神經(jīng)元的放電，電極尖端直徑1～2μm，阻抗10～20 MΩ，充灌液為0.5 mol/L醋酸鈉含2%滂胺天藍(lán)。細(xì)胞放電經(jīng)MEZ-8301微電極放大器，顯示于VC-11記憶示波器，以觀察電位波形、頻率和細(xì)胞放電的形式，同時信號輸入監(jiān)聽器監(jiān)聽。將信噪比大于3∶1的、穩(wěn)定的單細(xì)胞放電經(jīng)生物電信號采集與分析系統(tǒng)(CED1401 Spike2)輸入計(jì)算機(jī)后，作實(shí)時觀察、儲存和進(jìn)行頻率及放電形式的分析。采樣時間10～20 min。整個實(shí)驗(yàn)過程中監(jiān)測大鼠的心電，直腸溫度維持在(37±0.5)℃。電生理記錄完畢后，通過玻璃微電極電泳滂胺天藍(lán)，標(biāo)記最后一個記錄位點(diǎn)(－20μA，15 min)。大鼠深度麻醉后，經(jīng)左心室灌注生理鹽水150 ml，隨后用40 g/L多聚甲醛150 ml灌注固定。取腦后固定4 h，再置于200 g/L蔗糖溶液中過夜，行連續(xù)冠狀冰凍切片，片厚40μm，進(jìn)行尼氏染色，以確定記錄點(diǎn)位置。觀察假手術(shù)組大鼠的13個中間神經(jīng)元和模型組大鼠的34個中間神經(jīng)元的電活動的變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以x±s表示，組間神經(jīng)元放電頻率和放電形式參數(shù)的比較采用t檢驗(yàn);各類放電形式的比例的差異分別采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠電生理學(xué)分析 假手術(shù)組大鼠GABA能中間神經(jīng)元放電頻率為(11.95±0.81)Hz(n=13，放電范圍:1.61～24.57 Hz)，變異系數(shù)0.45±0.03。6-OHDA毀損組大鼠GABA能中間神經(jīng)元放電頻率為(7.28±0.78)Hz(n=34，放電范圍:2.36～31.2 Hz)，與假手術(shù)組相比顯著降低(P＜0.001)，變異系數(shù)為0.82±0.06，與對照組相比顯著增高(P＜0.001)。

2.2 兩組大鼠放電形式分析 假手術(shù)組大鼠GABA能中間神經(jīng)元呈現(xiàn)三種不同的放電形式，規(guī)則放電的比例為40%，不規(guī)則放電為43.6%，爆發(fā)式放電為16.4%。6-OHDA損毀組大鼠放電形式明顯趨向爆發(fā)式活動，與假手術(shù)組大鼠相比，6-OHDA毀損組大鼠規(guī)則放電的比例為11.5%，不規(guī)則放電為45.3%，爆發(fā)式放電為43.2%，爆發(fā)式放電顯著增多(P＜0.01)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)中所討論的神經(jīng)元均位于mPFC內(nèi)，其電活動的特征符合GABA能中間神經(jīng)元的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，屬于GABA能中間神經(jīng)元。本實(shí)驗(yàn)觀察到用6-OHDA損毀大鼠單側(cè)SNc后，mPFC的GABA能中間神經(jīng)元的放電頻率明顯降低，爆發(fā)式放電明顯增多;mPFC中GABA能中間神經(jīng)元頻率降低、爆發(fā)式放電活動增強(qiáng)可能和以下原因有關(guān):(1)mPFC接受腦VTA的DA神經(jīng)纖維傳入，并且表達(dá)D1和D2受體〔4〕。D1和D2受體不僅在錐體神經(jīng)元上有表達(dá)，在GABA能中間神經(jīng)元也有表達(dá)。電、化學(xué)刺激VTA可以興奮mPFC中GABA能中間神經(jīng)元電活動〔5〕。而且，當(dāng)微電泳DA時，也可以興奮mPFC中GABA能中間神經(jīng)元電活動〔6〕。這種興奮作用可能是直接通過突觸后D1和D2受體使GABA中間神經(jīng)元興奮。有實(shí)驗(yàn)證明系統(tǒng)給予D1受體激動劑可以使GABA中間神經(jīng)元活動增強(qiáng)，還有實(shí)驗(yàn)證明D2受體激動劑可以增加mPFC中細(xì)胞外GABA的含量〔7〕。有實(shí)驗(yàn)可以證明6-OHDA損毀SNc后VTA中的DA神經(jīng)元減少了40%左右〔8〕。而且，6-OHDA單側(cè)損毀內(nèi)側(cè)前腦束可以明顯減少mPFC中 D1和 D2受體表達(dá)。從這些實(shí)驗(yàn)可以看出，6-OHDA損毀SNc能導(dǎo)致VTA的DA神經(jīng)元的變性和mPFC中GABA能中間神經(jīng)元上DA受體表達(dá)的減少。(2)mPFC也接受DRN和MRN的5-HT神經(jīng)投射。有實(shí)驗(yàn)表明mPFC中GABA能中間神經(jīng)元表達(dá)5-HT2A受體。近期有實(shí)驗(yàn)證明GABA能神經(jīng)元也表達(dá)5-HT2C受體。5-HT可以通過5-HT2A受體和5-HT2C受體增加mPFC中GABA細(xì)胞外含量。神經(jīng)化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在PD患者基底神經(jīng)節(jié)、皮層和腦脊液中5-HT和5-HT的代謝產(chǎn)物5-羥乙哚乙酸顯著降低，特別是在具有抑郁的患者〔9〕。腦內(nèi)5-HT含量的減少是由于SNc DA能神經(jīng)元的變性引起了中腦縫核5-HT能神經(jīng)元的減少所致，這一推測也得到神經(jīng)病理學(xué)研究的證實(shí)，因?yàn)镻D患者尸檢發(fā)現(xiàn)在縫核50%以上的5-HT能神經(jīng)元丟失〔10〕。以上兩方面的原因可能是PD模型大鼠GABA能中間神經(jīng)元頻率降低的主要原因。另外，GABA能中間神經(jīng)元具有非常廣泛的分支，爆發(fā)式放電活動對GABA能中間神經(jīng)元具有非常重要的意義，因?yàn)檫@可以增加動作電位到達(dá)神經(jīng)末梢區(qū)域的可能性，從而增加該區(qū)域中GABA的釋放。因此，爆發(fā)式放電增多可能是一種代償作用。

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