賈第蟲病分子生物學診斷方法及其應用

商立民,金洪濤,劉 全

藍氏賈第鞭毛蟲病(giardiasis),簡稱賈第蟲病,是由藍氏賈第鞭毛蟲(Giardia lamblia)引起的一種以腹瀉為主要癥狀的腸道疾病,也有人稱藍氏鞭毛蟲病(lambliasis)。因賈第蟲病曾在國際旅游者中流行,故又稱為“旅游者腹瀉”。

自20世紀70年代以來,在世界各地相繼發生了本病的流行或暴發流行,相關的研究也確認賈第鞭毛蟲是導致人類腹瀉的最主要寄生性原蟲,估計每年導致約2.8億人感染[1]。近年來,在艾滋病患者中常發現有賈第蟲的合并感染,在同性戀人群中本病亦可互相傳播,賈第蟲已被認為是一種機會致病性原蟲,其重要性已引起各國重視。由于賈第蟲可感染人和多種野生動物及家養動物,故目前國際上已將賈第蟲病列入人獸共患寄生蟲病。

賈第蟲病呈全球性分布,據WHO估計,全世界人群感染率約為1%～20%,其臨床表現復雜多樣,從急慢性腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、胃腸脹氣到無明顯臨床癥狀[2],極易與其他疾病相混淆,從而忽視或延誤了本病的治療,因此快速、準確診斷對本病的治療和監控起著十分重要的作用,本文就賈第蟲病的分子生物學診斷方法及其應用加以綜述。

1 多聚酶鏈反應(PCR)

對賈第蟲進行鑒定和基因分型的靶基因主要有:小亞單位rRNA基因(SSU-rRNA)、β賈第素基因(β-giardin)、谷氨酸脫氫酶基因(gdh)、α-延伸因子1基因(ef-1)、磷酸丙糖異構酶基因(tpi)等[3]。Rebecca等應用PCR方法檢測賈第蟲小亞單位rDNA基因和傳統的檢測方法對曼谷204份人糞便和229份犬糞便進行檢測比較,結果顯示PCR方法具有較高的特異性和敏感性[4]。通過對上述賈第蟲特定基因的擴增和序列分析,比較其基因片段的特異性,對賈第蟲進行分型,將其分為了7個有效聚集體,即聚集體(A-G)。Erica等對從灰海豹糞便中提取賈第蟲基因組,用谷氨酸脫氫酶基因(gdh)進行分型鑒定,在原有的七種聚集體之外發現了第八種聚集體,即集聚體H,這種新聚集體的發現說明賈第蟲具有更為豐富的遺傳多樣性和更為廣泛的宿主范圍[5]。

2 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)

Real-time PCR方法能夠對特異核酸擴增的全過程進行連續的實時監測,能夠測定樣品起始模板的核酸含量,從而對樣品中含有的蟲體數量進行定量檢測。此外,相對于傳統的PCR方法Real-time PCR具有更高的敏感性,而且能夠在閉合管內進行高通量分析,無需對擴增產物進行電泳分析,避免了樣品污染的可能[6]。

Adriana等用Real-time PCR法與傳統的鏡檢和抗原檢測方法對意大利疑似腸道寄生蟲感染的771份患者糞便樣品進行檢測,與傳統方法相比較Real-time PCR具有100%的特異性和敏感性[7]。Verweij等用Real-time PCR方法對賈第蟲小亞單位rRNA基因進行擴增檢測,對104份已知含有賈第蟲包囊的糞便標本檢測,102份陽性,特異性達到98.1%;對賈第蟲抗原陽性的糞便標本進行檢測亦呈陽性[8]。Binz等應用探針法熒光定量PCR技術能夠檢測出0.8個賈第蟲滋養體,具有較高的特異性和敏感性[9]。

3 反轉錄PCR(RT-PCR)

盡管常規PCR方法對樣本中存在的賈第蟲檢測具有高度的特異性和敏感性,但不能區分包囊是否具有活性和感染力,因此在對環境樣品檢測時,需要建立一種特異的方法來檢測環境中樣本是否含有有活性的包囊,由于 RT-PCR依賴于mRNA的完整性,而 mRNA的半衰期通常較短,因此完整的mRNA即可證實活性包囊的存在。應用RT-PCR方法檢測賈第蟲mRNA即可檢出樣品中是否含有活性包囊。由于包囊在熱應激條件下可大量合成熱休克蛋白(hsp)70,因此RT-PCR通常將熱休克蛋白(hsp)70作為目的基因進行檢測,能夠增加檢測活性包囊的敏感性[10]。

Gyu-Cheol等針對賈第蟲的熱休克蛋白(hsp)70基因設計特異的引物對水生系統中有活性的包囊進行檢測,檢測的敏感性可達到1個包囊/100μL,在熱應激的條件下檢測的敏感性可以增加1000倍,這種檢測的高敏感性在檢測環境樣品中是否含有活性的包囊具有重要意義[11]。

4 多重PCR(multiplex PCR)

多重PCR是通過在同一PCR反應體系里加上二對以上引物,同時擴增出多個核酸片段的PCR反應,可以對多種致病因子進行鑒定和檢測,具有高效性、經濟性和簡便性等特點[12]。

Stark D等應用多重PCR技術與real-time PCR(RT-PCR)相比較用來檢測包括賈第蟲在內的4種常見的致病原蟲,發現多重PCR與RT-PCR的符合率達到100%,而且多重PCR具有很高的特異性和敏感性,沒有交叉反應發生[13]。Taniuchi M 等應用多重PCR技術對腸道寄生蟲檢測的敏感性和特異性分別為83%和100%,故可用此方法對腸道寄生蟲進行篩選[14]。

5 基因芯片技術(microarray)

基因芯片技術(microarray)是指將成千上萬DNA克隆片段或寡核苷酸片段固定在固體表面(玻璃片或尼龍膜)上,用熒光或其他標記的mRNA,cDNA或基因組DNA探針進行雜交,從而同時快速檢測多個基因表達狀況,進行DNA分析等的一種技術,其基本原理是基于Southern雜交或斑點雜交技術。基因芯片技術應用于基因表達水平檢測的最大優越性是可自動、快速檢測目的材料中成千上萬個基因的表達情況。

Dae-Young等研制了針對小亞基 rRNA基因檢測包括賈第蟲在內的三種原蟲基因芯片技術,其檢測的敏感性可達到50個包囊/次,該技術能夠避免環境樣品中存在的PCR抑制劑對PCR檢測的影響,具有很好的特異性,不與非靶基因發生交叉反應也無假陰性反應[15]。Wang等研制的寡核苷酸微陣列技術不僅能夠對賈第蟲進行檢測,而且還能對其進行基因分型,其高度的敏感性和特異性為大量臨床和環境樣品的檢測和基因分型提供了一種行之有效的方法[16]。

6 熒光原位雜交(FISH)

熒光原位雜交技術的基本原理是應用熒光標記的核酸探針與同源互補的靶DNA經變性-退火-復性,形成靶DNA與核酸探針的雜交體,經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

Lemos等用FISH方法與賈第蟲18S rRNA進行雜交對賈第蟲進行檢測[17],Dorsch等針對賈第蟲16S rRNA設計的熒光標記的寡核苷酸探針,利用rRNA只在有活性的包囊中高效表達的特性,對賈第蟲有活性的包囊進行檢測[18],Graczyk等將熒光原位雜交技術與針對賈第蟲細胞壁抗原決定簇的FITC標記的單克隆抗體技術相結合,能夠對賈第蟲有活性的單個包囊進行檢測[19]。

7 環介導等溫擴增(LAMP)

環介導等溫擴增技術是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物,在具有鏈置換活性功能的DNA聚合酶的作用下實現等溫條件下DNA分子的核酸擴增技術,該方法具有特異性高、操作方便等特點[20]。

Nago TT等應用LAMP技術對賈第蟲病患者的糞便樣本進行檢測,結果顯示檢測敏感性為84%(16/19),能夠檢出的最少蟲體數可達到3.12×10-1個,相對于傳統的鏡檢方法敏感性提高了400倍以上,從而為臨床樣本的檢測提供了一種高敏感性和準確性的方法[21]。

8 展 望

分子生物學技術為賈第蟲的快速診斷提供了一個平臺,各種檢測方法的應用使我們對賈第蟲的生物學有了更進一步的認識。視檢測目的不同,采用不同的檢測方法,PCR方法可以對賈第蟲進行檢測、基因分型和流行病學調查,Real-time PCR可對環境樣品賈第蟲含量進行定量分析,RT-PCR主要是對環境樣品中含有的包囊進行活性和感染力的檢測,多重PCR可同時檢測多種寄生蟲,基因芯片技術可同時對多個不同的目的基因進行檢測等。隨著分子生物學的迅速發展以及其在賈第蟲方面的廣泛應用,將有助于對賈第蟲的宿主特異性、傳播途徑和流行趨勢等方面有更好的了解。

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