登革熱血清學診斷研究進展*

譚 俊,楊亞明,周紅寧

登革熱(dengue fever,DF)是由黃病毒屬的登革病毒(dengue virus,DENV)通過埃及伊蚊或白紋伊蚊叮咬傳播引起的一種急性蚊媒傳播疾病,現已成為全球性的嚴重公共衛生問題。目前登革病毒診斷方法主要包括病毒分離、分子生物學檢測和血清學方法。其中,前者作為登革病毒診斷的金標準,不但可以檢出病毒的存在,還能對病毒的型別進行鑒定,但該方法比較耗時,而且需要一定的儀器設備和專業技術人員[1];從 Banditti早期報道的巢式RT-PCT檢測到現在實時熒光PCR檢測的應用以及核酸序列擴增技術,分子生物學檢測技術在這近十幾年來有了較大的發展,其敏感性、特異性和重復性都有了很大的提高,但該方法也存在較高的實驗室設備和專業技術人員要求;而利用抗原或抗體檢測原理的血清學實驗方法,具有操作方便、試劑廉價、診斷快速等特點,較適用于現場診斷,并得到了廣泛的應用。

登革病毒的血清學診斷方法主要包括血凝抑制(Hemagglutination inhibition,HI)試驗,中和試驗(Neutralization Test,NT)、間接免疫熒光抗體試驗(Indirect Immunofluorescent Assay,IIF)、酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)、補體固定試驗(Complement fixation,CF)、斑點印跡、免疫層析法(Immunochromatographic Test,ICT)等。這些方法主要就是對抗原(ELISA、斑點印跡、ICT)或者抗體(HI、NT、IIF、CF、ELISA、ICT、斑點印跡)進行檢測。大量的應用實踐發現,目前最常用的方法主要為 ELISA、ICT和比較傳統的HI試驗及NT試驗。

1 抗原檢測

在初次和二次感染的患者急性期血清中都可以通過酶聯反應和斑點試驗檢測到高濃度、以免疫復合物形式存在的包膜蛋白(envelope,E)/膜蛋白(membrane,M)抗原和非結構蛋白1(nonstructural protein 1,NS1)抗原,甚至在患者發病后9d仍能檢測到這些抗原[2]。前者(envelope,E)是登革病毒的主要包膜蛋白,全長494個氨基酸,相對的分子量近60000;不但含有中和抗原表位、型特異表位,還有登革病毒種及黃病毒屬特異性表位。E蛋白的A、B兩區存在與中和抗體和血凝作用有關的抗體表位,可以誘導宿主產生保護性的中和抗體以及血凝抑制抗體[3]。此外,該蛋白還可能會引起抗體依賴的增強感染作用(ADE),而ADE可導致DHF和DSS的產生。M蛋白(membrane,M)形成病毒毒粒的表面結構,分子量約為8000,由其前體PrM糖蛋白經過特異性酶切后形成;研究發現,M蛋白具有促進病毒感染增強的作用[4]。NS1蛋白屬于登革病毒中一種高度保守的非結構性糖蛋白,具有較高的同源性,分為包內型、膜型和分泌型。研究發現其抗原性很強,含有多個 T、B細胞表位,能夠誘發細胞和體液免疫應答,此外,在登革熱病人的血清中還存在較高水平的循環NS1抗原和NS1特異性抗體[5-7],且出現時間也早于IgM 抗體[8]。Sophie Alco等人通過研究發現,甚至在檢測不到登革病毒RNA或已有登革病毒IgM抗體存在的情況下,也可能有效檢測出NS1蛋白;他們對登革病毒感染者一出現發熱到臨床期結束的整個過程進行觀察發現,登革病毒NS1蛋白均能在各個時間段內的病人血清中檢測到,只不過各個時間段NS1蛋白滴度含量有所不同[9]。

目前針對E/M蛋白和NS1蛋白檢測的方法主要有ELISA和斑點免疫測定,其中ELISA法較為常用[10]。2006年徐華等人采用DEN-1 NS1抗原捕獲ELISA的方法,對16例臨床診斷為DEN1感染患者急性期的血清樣品進行檢測;并把 DEN-1 NS1抗原檢測陽性樣本品15份與試劑盒IgM抗體(澳大利亞PanBio)檢測結果進行對比發現,兩種方法檢測結果中有13例吻合(即IgM抗體和DEN1-NS1抗原檢測同時陽性);其余2例IgM抗體陰性,而DEN1-NS1抗原檢測呈陽性,結果提示該方法在登革熱的發病早期檢出效果可能要優于IgM抗體的檢測[11]。陳萬山等人分別采用傳統的病毒分離鑒定法、RT-PCR法以及IgM抗體檢測法與ELISA捕獲NS1抗原檢測法進行對比發現,在登革病毒感染患者發病1～2d、3～5d以及6～10d的血清中,NS1抗原的檢出率分別是92.7%(38/41)、83.3%(70/84)、10.9%(5/46),特異性為 100%;而 IgM抗體檢測方法分別為 2.4%(1/41)、51.2%(43/84)、97.8%(45/46),特異性為95.2%;RT-PCR 法在發病的1～2d,與ELISA檢測NS1法結果的差異性不大(P＞0.05);但病毒分離方法比NS1抗原方法的檢出率要低(P＜0.05)[12]。

此外,Philippe Dussart采用ICT檢測NS1法(Dengue NS1 Ag STRIP)和兩步夾心格式微孔板ELISA檢測NS1法(pan-E Dengue Early ELISA)與一步夾心格式微孔板ELISA檢測NS1法(the Platelia Dengue NS1 Ag Test)進行檢測比較發現,Dengue NS1 Ag ST RIP檢測法的敏感性和特異性分別為76.1%(207/272)和 100%(48/48);而 pan-E Dengue Early ELISA檢測法的敏感性和特異性分別為 55.1%(150/272)和 97.9%(47/48);the Platelia Dengue NS1 Ag test的敏感性和特異性分別為 82.4%(224/272)和 100%(48/48)[13]。該比較結果說明the Platelia Dengue NS1 Ag test是三者中檢測效果最好的,可作為早期診斷DEN感染的方法。

2 抗體檢測

登革感染者血清中的抗體檢測常見的有血凝抑制(Hemagglutination-inhibition)抗體、中和(Neutralization)抗體、IgM 和IgG。其中,血凝抑制抗體是一種能夠抑制登革病毒促使紅細胞發生凝集現象的特異性抗體,長期以來測定血凝抑制抗體的血凝抑制試驗(HI)被廣泛應用于登革病毒感染的檢測。一般初次感染者急性階段的抗體多在發病后第5～6d才可檢測到(抗體滴度通常大于1∶10);而對于二或三次感染時,抗體滴度通常在發病后第1d就會迅速上升(一般大于1∶24),因此,急性期血清標本抗體滴度在1∶1 280以上時,提示近期有登革病毒感染[14-15]。但最近有學者研究發現,針對登革病毒的初次和二次感染者,HI試驗和EILSA試驗的檢測結果吻合率僅有88%,其原因還有待進一步的研究證實[16]。中和抗體是當人體感染登革病毒后所產生的一種保護性抗體,可以抑制登革病毒的吸附、穿入、從而使其失去感染能力。傳統檢測中和抗體的實驗方法多為空斑減少中和試驗,該實驗具有較高的敏感性和特異性,特別是針對于初次感染的血清型鑒定。但對于二或三次感染者,由于原始抗原痕跡(original antigenic sin,OAS)作用的存在,使中和抗體試驗的可靠性明顯降低[17-18]。因此,該實驗只適用于初次感染的登革熱診斷[14]。

一般來說,初次感染登革病毒,IgM通常在發病后的5d出現,1～3周內達到高水平,并可維持2個月,有的甚至在6個月時還能檢測到;而IgG抗體的出現時間要比IgM晚,多在感染后的2周出現,并可維持終生。在二次感染時,IgM則出現的比較晚,且所產生的水平也較低,維持的時間也不長,常使得一些患者較難檢測到IgM;而IgG的產生時間就很快,一般是在出現癥狀后的1～2d出現,且抗體水平也比既往的要高。為此,在實際應用中,對于初次登革病毒的檢測,IgM一般用于檢測發病后1周所采集的血液,發病2周后采集的血液就可以采取IgG抗體檢測;對于二次感染,在檢測可疑病人的血清時,建議同時檢測IgM和IgG兩種抗體[14]。

目前對兩種IgM和IgG抗體檢測的主要方法有ELISA法、ICT以及IIF(主要檢測IgG)。其中,以膠體金快速免疫層析法為代表的ICT檢測法是目前較常用的現場快速診斷方法。一方面它對登革熱的診斷速度快,僅需5～10min而且不需要特定的實驗室設備和專業的技術人員,在現場就可以完成檢測;另一方面采用該方法既可檢測IgM,又可檢測IgG,而且對是否初次或二次感染都可做出初步判斷[19-20]。Lam和Devine早在1998年就提出快速免疫層析法對早期快速診斷登革熱感染是非常有價值的。他們用快速免疫層析試驗和ELISA捕獲法在登革感染期間,對IgM 和IgG抗體進行檢測,結果發現,兩種方法的敏感性和特異性都較高,分別為100%和 89%[21]。David W.Vaughn和 Ananda Nisalak等人用ICT對登革病毒感染患者的血清檢測IgM和IgG抗體時發現,其敏感性和特異性也分別高達100%和88%[19]。何似、陳潤等人采用ICT和IIF對56份疑似登革熱病人的血清和68份無癥狀人群的血清分別進行了IgG的檢測,在前者血清的兩種檢測方法比較中發現,IIF法檢測的陽性率為53.6%(30/56),ICT檢測的陽性率為46.4%(26/56),兩法符合率 91.07%,無顯著差異(P＞0.05);但在后者血清的檢測中,IIF法檢查的陽性率為 54.4%(37/68),而 ICT檢測得陽性率為33.8%(23/68);兩法符合率73.53%,存在顯著差異(P＜0.01)[22]。此外,徐建民采用抗體捕獲ELISA法和快速免疫層析法分別對2000年的322份標本(其中4份確診為登革熱病人)和1999年的311份標本(其中2份確診為登革熱病人)進行了檢測,通過對結果數據的比較揭示,快速免疫層析法特別適于在登革熱暴發流行期間作初篩試驗[23]。

3 束 語

近十幾年來,血清學試驗技術有了迅速的發展,之間不斷有新的檢測技術出現。如捕獲NS1抗原的ELISA法,其靈敏值可達到10ng/ml。Sophie Alcon等建立了類似檢測NS1蛋白的方法,參比蛋白采用1型登革病毒NS1蛋白,包被抗體和酶標抗體分別為抗登革病毒1型鼠多克隆抗血清和兔多克隆抗血清,該方法甚至可以檢測到含量低于 1ng/mL的DEN-1 NS1蛋白,但同樣的檢測水平對于其它型的NS1蛋白不成立,其敏感性可低至10倍[9]。這種差異可能是所用的多抗血清只針對DEN-1 NS1蛋白,由于登革病毒NS1蛋白的氨基酸序列同源性并不是很高(一般不超過80%),使得該多抗血清與其它型的登革病毒NS1蛋白的反應效率降低[24]。因此,使用針對某一種型別的NS1抗原不但可以提高該型登革病毒檢測方法的靈敏性,還有可能對病毒的型別進行鑒定。最近研究報道,針對于I型和III型登革病毒的NS1特異性單抗已經成功制備[11,25];這些都預示著ELISA捕獲NS1抗原檢測法在未來可以作為早期檢測登革病毒的首選方法。但是該方法目前仍不能對初次或再次感染情況進行判斷,這還有待進一步的研究。而快速免疫層析法(ICT),雖然對初次或二次感染都可作出初步判斷,并具有診斷時間快、操作簡便等優點,但該方法在病例散發情況下或對無癥狀人群檢測時,出現的假陽率比較高,而且有些病人在感染后的7～10d內,抗體水平也較低;只有當病人癥狀持續出現時,再次采樣測試,才會有較好的效果[22-23]。此外,該方法不能對登革病毒的型別進行鑒定,仍然需要依靠RT-PCR、病毒分離等方法來完成[26]。

[1]Kao CL,King CC,Chao DY,et al.Laboratory diagnosis of dengue virus infection:current and future perspectives in clinical diagnosis and public health[J].J Microbiol Immunol Infect,2005,38(1):5-16.

[2]Shu PY,Chen LK,Chang SF,et al.Dengue virus serotyping based on envelope and membrane and nonstructural protein NS1 serotype-specific capture immunoglobulin M enzyme-linked immunosorbent assays[J].J Clin Microbiol,2004,42(6):2489-2494.

[3]方美玉,林立輝.登革病毒的研究進展[J].中華傳染病雜志,2000,18(2):138-141.

[4]Randolph VB,Winkler G,Stollar V.Acidotropic amines inhibit proteolytic processing of flavivirus prM protein[J].Virology,1990,174(2):450-458.

[5]Wu H,Huang YL,Chao T T,et al.Identification of B-cell epitope of dengue virus type 1 and its application in diagnosis of patients[J].J Clin Microbiol,2001,39(3):977-982.

[6]Qu X,Chen W,Maguire T,et al.Immunoreactivity and protective effects in mice of a recombinant dengue 2 Tonga virus NS1 protein produced in a baculovirus expression system[J].J Gen Virol,1993,74(1):89-97.

[7]Shu PY,Chen LK,Chang SF,et al.Dengue NS1-specific antibody responses:isotype distribution and serotyping in patients with dengue fever and dengue hemorrhagic fever[J].J Med Virol,2000,62(2):224-232.

[8]Masaru N,Ken-Ichiro Y,Tomohiko T,et al.Serotype-cross-reactive immunoglobulin M responses in Dengue virus infections determined by enzyme-linked immunosorbent assay[J].Clin Diagn Lab Immunol,2000,7(5):774-777.

[9]Alcon S,T alarmin A,Debruyne M,et al.Enzy me-linked immunosorbent assay specific to Dengue virus type 1 nonstructural protein NS1 reveals circulation of the antigen in the blood during the acute phase of disease in patients experiencing primary or secondary infections[J].J Clin Microbiol,2002,40(2):376-381.

[10]貢樹基,趙衛,曹虹.登革病毒感染實驗室診斷的研究進展[J].中國人獸共患病雜志,2005,21(12):1103-1105.

[11]徐華,郝衛,潘玉先,等.I型登革病毒NS1抗原捕獲ELISA的建立和初步臨床診斷應用[J].中華微生物學和免疫學雜志,2006,26(9):850-854.

[12]陳萬山,張復春,盧業成,等.固相酶聯免疫測定法檢測NS1抗原在登革病毒感染早期診斷中的應用[J].熱帶醫學雜志,2007,7(8):742-744.

[13]Dussart P,Petit L,Labeau B,et al.Evaluation of two new commercial tests for the diagnosis of acute dengue virus infection using NS1 antigen detection in human serum[J].PLoS Negl T rop Dis,2008,2(8):e280.

[14]衛生部疾病預防控制局.登革熱防治手冊[M].2版.北京:人民衛生出版社,2008:1-80.

[15]De Paula SO,Fonseca BA.Dengue:a review of the laboratory tests a clinician must know to achieve a correct diagnosis[J].Braz J Infect Dis,2004,8(6):390-398.

[16]Atchareeya A,Songthum P,Areerat S,et al.Comparison between haemagglutination inhibition(HI)test and IgM and IgG-capture ELISA in determination of primary and secondary dengue virus infections[J].Dengue Bulletin,2006,30:141-145.

[17]Barbara W.Johnson,Olga Kosoy,Elizabeth Hunsperger,et al.Evaluation of chimeric japanese encephalitis and dengue viruses for use in diagnostic plaque reduction neutralization T ests[J].Clin Vaccine Immunol,2009,16(7):1052-1059.

[18]Johnson BW,Kosoy O,M artin DA,et al.West Nile virus infection and serologic response among persons previously vaccinated against yellow fever and Japanese encephalitis viruses[J].Vector Borne Zoonotic Dis,2005,5(2):137-145.

[19]David W V,Ananda N,Siripen K,et al.Evaluation of a rapid immunochromatographic test for diagnosis of dengue virus infection[J].J Clin Microbiol,1998,36(1):234-238.

[20]Chew Theng Sang,Lim Siew Hoon,Andrea Cuzzubbo,et al.Clinical Evaluation of a Rapid Immunochromatographic Test for the Diag nosis of Dengue Virus Infection[J].Clin Diag n Lab Immunol,1998,5(3):407-409.

[21]Lama SK,Devineb PL.Evaluation of capture ELISA and rapid immunochromatographic test for the determination of IgM and IgG antibodies produced during dengue infection[J].Clinical and Diagnostic Virology,1998,10(1):75-81.

[22]何似,陳潤,李世清,等.快速免疫色譜測試法與免疫熒光法檢測登革病毒IgG抗體的比較[J].中國人獸共患病雜志,2001,17(2):56-58.

[23]徐建敏,何麗娟,狄飚.登革熱抗體三種檢測方法的比較[J].中國人獸共患病雜志,2002,18(4):92-93.

[24]郝永華,王芹,關武祥,等.抗登革病毒NS1單抗的制備及檢測NS1方法的建立[J].病毒學報,2006,22(4):292-296.

[25]晉晶,潘玉先,丁細霞,等.Ⅲ型登革病毒NS1單克隆抗體的制備及鑒定[J].廣東醫學,2007,28(11):1726-1729.

[26]姚海軍,段馥琴.免疫層析法在診斷登革病毒感染中的應用[J].中國衛生檢驗雜志,2000,10(3):267-269.