吉非替尼對(duì)臍帶來源間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)MCP-1的抑制作用

王 林 陳 紅 王 原 杜改萍 陳銀蘋 俞亮科 孫曉東

(河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，河北 唐山 063000)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)廣泛應(yīng)用于組織工程和細(xì)胞治療〔1〕。MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)作用，抑制樹突細(xì)胞呈遞抗原，改變單核巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的轉(zhuǎn)化〔2〕。有研究報(bào)道，來源于臍帶組織的MSCs(UC-MSCs)有類似來源于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的特性〔3〕。而且，臍帶MSCs取材方便，對(duì)供者無損傷。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是促進(jìn)MSCs增殖的重要生長(zhǎng)因子。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)EGF可促進(jìn)MSCs向脂肪和骨組織分化，并且可以產(chǎn)生破骨細(xì)胞形成促進(jìn)因子(RANKL)，單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等單核巨噬細(xì)胞趨化因子，尤其是MCP-1對(duì)于單核巨噬細(xì)胞的生物學(xué)活性有重要的調(diào)節(jié)作用〔4〕。吉非替尼作為EGF受體的特異性抑制劑已經(jīng)在臨床中廣為使用，多數(shù)癌癥患者從中受益。然而，吉非替尼是否能夠抑制EGF對(duì)MSCs的作用，尤其是調(diào)節(jié)MCP-1表達(dá)從而改變單核巨噬細(xì)胞的功能活性值得探討。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) UC-MSCs培養(yǎng)方法參照文獻(xiàn)〔3〕。用磷酸鹽緩沖液沖洗臍帶組織樣本，然后用0.075%Ⅰ型膠原酶37℃、30 min消化樣本，然后用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中和酶的活性，再將樣本以1 200 r/min，10 min離心10 min，將沉淀物用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素及100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2孵箱。EGF購(gòu)自R＆D公司。吉非替尼為臨床應(yīng)用藥物，購(gòu)自AstraZeneca。

1.2 方法

1.2.1 分組 分為空白對(duì)照組、EGF處理組、吉非替尼處理組、EGF聯(lián)合吉非替尼處理組。EGF、吉非替尼作用濃度分別為10 ng/ml、4 μmol/L。聯(lián)合組為EGF先作用24 h后再加吉非替尼作用4 h。

1.2.2 Real-Time PCR分析 根據(jù)產(chǎn)品說明書，采用TRIzol○RReagent(購(gòu)自invitrogen公司)提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以SYBR Green為高靈敏的DNA熒光染料(購(gòu)自ABI公司)執(zhí)行Real-Time PCR分析。分析所用的引物序列為:β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(對(duì)照):5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3'，5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3';MCP-1:5'-GTCCTTCGGGCTCCTTGT-3'，5'-AACTTGCTTCCCGTTCTTCA-3'。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)鑒定用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)UC-MSCs 2 d不影響細(xì)胞活力，遂收集上清，并用ELISA試劑盒(R＆D公司)測(cè)定上清中MCP-1的濃度。按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 分別收集各處理組的UC-MSCs培養(yǎng)上清，置于0.8 μm孔徑的Transwell板(購(gòu)自Nunc公司)中，于半透膜上層加入1×104單核細(xì)胞系RAW264.7(購(gòu)自美國(guó)ATCC)。4 h后于顯微鏡以不同高倍視野(5個(gè)高倍視野)下計(jì)數(shù)細(xì)胞每個(gè)高倍視野平均細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)資料以±s表示，組間均數(shù)比較用兩樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 UC-MSCs中MCP-1表達(dá) 空白對(duì)照組、EGF組、吉非替尼組、EGF聯(lián)合吉非替尼組MCP-1濃度分別為〔(7 632±532)、(1 654±627)、(496±421)、(1 081±723)ng/ml〕，對(duì)照組與其余3組比較差異顯著(P＜0.05)，EGF組與EGF聯(lián)合吉非替尼組比較差異顯著(P＜0.05)，可見吉非替尼可有效抑制EGF對(duì)UC-MSCs表達(dá)和刺激MCP-1分泌的作用。

2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果 空白對(duì)照組、EGF組、吉非替尼組、EGF聯(lián)合吉非替尼組的單核巨噬細(xì)胞數(shù)分別為56.0±12.79、160.4±12.24、56.2±9.77、111.4±11.57，EGF組與 EGF聯(lián)合吉非替尼組比較差異顯著(P＜0.05)。

3 討論

本研究證實(shí)，EGF可以顯著刺激UC-MSCs分泌MCP-1，這種刺激體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平(實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè))和蛋白水平(ELISA檢測(cè))。同樣MCP-1分泌變化對(duì)單核巨噬細(xì)胞的趨化功能有顯著影響。作為EGF的抑制劑，吉非替尼在臨床中廣為應(yīng)用〔4，5〕。目前主要是針對(duì)惡性腫瘤，尤其是特異性高表達(dá)生長(zhǎng)因子受體的腫瘤，例如肺癌等。作為一種多效應(yīng)靶點(diǎn)的生長(zhǎng)因子，EGF除了能夠刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)以外，對(duì)于機(jī)體各種其他成分的組成細(xì)胞也都有一定的促增殖作用。研究表明，EGF可以作為MSCs的有效擴(kuò)增因子，對(duì)于干細(xì)胞的產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用有重要的意義〔5，6〕。此外，EGF還可以促進(jìn) MSCs向骨組織、脂肪組織等分化。近年來注意到EGF可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一些趨化因子，尤其是MCP-1蛋白。作為單核巨噬細(xì)胞特異性的趨化因子，MCP-1在誘導(dǎo)單核細(xì)胞成熟、趨化以及參與炎癥和腫瘤組織浸潤(rùn)等生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用〔2，7〕。

前期研究觀察到，EGF可以有效地促進(jìn)MSCs分泌MCP-1，促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的招募，在腫瘤發(fā)展過程中，MSCs可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥性單核巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。而本研究發(fā)現(xiàn)，給予吉非替尼處理后，EGF對(duì)MSCs分泌MCP-1具有抑制作用，這種抑制作用的效果在抑制MSCs招募單核巨噬細(xì)胞趨化過程中得以體現(xiàn)，從一個(gè)較新的角度提示吉非替尼對(duì)EGF受體相關(guān)腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的抑制作用，為臨床治療腫瘤提供了一種新的思路和探索。

總之，吉非替尼可以有效抑制EGF對(duì)UC-MSCs作用，調(diào)節(jié)MCP-1分泌及其對(duì)單核巨噬細(xì)胞招募作用。結(jié)果不僅提示UC-MSCs與機(jī)體免疫細(xì)胞的相關(guān)性，也為吉非替尼抑制EGF相關(guān)腫瘤浸潤(rùn)移植治療提供新的觀點(diǎn)。

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