CD4+CD25+Treg細胞、TGF-β1和IL-10在上皮性卵巢癌中的變化

沈 瑋 田 庚 (吉林省婦幼保健院，吉林 長春 3006)

CD4+CD25+調節性 T細胞(regulatory T cell，Treg)是健康個體T細胞庫的組成成分，是一類具有免疫抑制效應的細胞，能抑制T細胞對外源和自體抗原的免疫反應，因此在維持對自身成分免疫耐受的同時，也可能阻止機體對自體同源腫瘤細胞的免疫。因此，CD4+CD25+Treg細胞很可能影響著免疫系統對腫瘤抗原的應答，從而影響腫瘤的發生和發展。CD4+CD25+Treg細胞可通過分泌抑制性細胞因子TGF-β1和IL-10發揮免疫下調作用〔1〕。

Brunkow等〔2〕報道，胸腺和外周淋巴組織中自然產生的CD4+CD25+Treg細胞可特異表達一種轉錄因子Foxp3，Foxp3是Treg細胞發育的一個關鍵轉錄因子〔3〕。

本文檢測上皮性卵巢癌患者外周血中CD4+CD25+Treg細胞數量及其相關基因Foxp3 mRNA的表達以及TGF-β1和IL-10含量的變化，探討CD4+CD25+Treg細胞與腫瘤發生、發展的關系及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 卵巢癌患者20例(來自吉林大學第二醫院)，其中漿液性囊腺癌13例，黏液性囊腺癌7例，年齡28～64〔平均(43.14±9.48)〕歲。非腫瘤患者10例作對照，年齡21～53〔平均(37.4±10.26)〕歲。腫瘤患者術前未進行放、化療，抽取靜脈血2 ml，EDTA抗凝。所有病例均手術病理確診。

1.2 標本采集、處理 EDTA抗凝血2 ml，應用Ficoll密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞(PBMC)，計數，取1×106個細胞標記抗CD4-PE單克隆抗體和抗CD25-FITC單克隆抗體進行FACS檢測，剩余細胞加入Trizol試劑后置－80℃冰箱凍存，備RT-PCR檢測。外周靜脈血3 ml，4℃靜置3 h，3 000 r/min離心20 min，分離血清，－70℃儲存以備ELISA檢測使用。重組TGF-β1及IL-10 ELISA試劑盒購自上海森雄公司。

1.3 FACS檢測 熒光抗體標記的淋巴細胞懸液4℃下避光孵育30 min，PBS洗滌，然后進行FACS檢測。

1.4 RT-PCR反應 cDNA的逆轉錄采用Takara的AMV RTase，按說明書進行操作。通過預實驗確定PCR反應條件和最適循環數，以保證PCR產物量與起始cDNA量呈線性相關。①人Foxp3的引物:正義5'-CTACGCCACGCTCATCCGCTGG-3'和反義:5'-GTAGGGTTGGAACACCTGCTGGG-3'，片段大小為260 bp。②內參β-actin引物序列為:正義:5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGG-3';反義:5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'，片段大小:224 bp。采用Ex Taq DNA聚合酶，反應條件為:94℃預變性 5 min，隨后進行40 次循環(94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 30 s)，最后72℃延伸10 min。

1.5 RT-PCR產物的檢測 取5 μl PCR產物點樣于1.5%的瓊脂糖凝膠，其中含0.5 μg/ml溴乙錠。5 V/cm進行電泳，凝膠掃描成像系統記錄電泳結果。用Imagemaster VDS(Pharmacia Biotech)圖像分析軟件分析光密度值，以Foxp3/β-actin光密度比值表示Foxp3 mRNA表達水平，瓊脂糖電泳以100 bp DNA ladder V(鼎國)相對分子質量為標準，實驗各組RT-PCR擴增的Foxp3及β-actin條帶與相對分子質量標準位置相同。

1.6 TGF-β1和IL-10含量的測定 按TGF-β1及IL-10 ELISA試劑盒說明書繪出標準曲線。利用同一條件下測得的標本OD值，實驗組和對照組血清濃度依標準曲線查出，計算濃度時乘以稀釋倍數。

2 結果

2.1 各組外周血中CD4+CD25+/CD4+T細胞比例的差異

漿液性囊腺癌患者外周血CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例〔(23.48±12.23)%〕較非腫瘤病人〔(11.17±7.35)%〕明顯增高(P＜0.05)。黏液性囊腺癌病人外周血CD4+CD25+T細胞占CD4+T細胞的比例〔(21.41±8.91)%〕與非腫瘤病人相比較也明顯增高(P＜0.05)。

2.2 人PBMC中FOXP3 mRNA的表達 漿液性囊腺癌〔(6.28±1.08)%〕和黏液性囊腺癌〔(5.17±0.95)%〕病人外周血PBMC中Foxp3 mRNA表達量均明顯高于非腫瘤病人〔(3.43±0.51)%〕(P＜0.05)。

2.3 外周血中TGF-β1、IL-10的含量 漿液性及黏液性囊腺癌患者外周靜脈血中 TGF-β1的含量〔(51.48±12.23)%，(49.41±10.91)%〕較非腫瘤病人〔(18.17±7.35)%〕均明顯增高(P＜0.05)。漿液性及黏液性囊腺癌患者外周靜脈血中IL-10的含量〔(15.83+5.16)%，(16.56+4.24)%〕較非腫瘤病人〔(6.39+2.85)%〕也明顯增高(P＜0.05)。

3 討論

在生理狀態下，機體免疫系統具有免疫監視作用防止腫瘤的發生。然而，研究表明在癌癥患者中免疫系統對腫瘤抗原常表現為弱的免疫應答，從而不能有效清除腫瘤細胞，導致臨床腫瘤的發生。這種對腫瘤抗原弱免疫應答的原因很可能是由于腫瘤抗原為變化了的自身抗原，因此，維持自身耐受的機制也在對腫瘤發揮著耐受作用，使之“逃逸”免疫監視。

研究表明，正常情況下機體內Treg的免疫學意義是維持機體免疫穩態，其作用方式是動態調節機體免疫平衡，有防止免疫反應無限制擴大及抑制自身免疫反應發生的作用。體內Treg的數量和功能狀態對機體免疫穩態的維持有重要意義，理論上Treg數量過少或功能不足會出現相應的免疫性損害，甚至出現自身免疫性疾病。這種情況已在很多疾病中得到證實。但Treg數量過多或功能過強的情況不多，目前還主要在腫瘤患者上有報道。

CD4+CD25+Treg在機體內維持一定水平，因此在正常人外周血中能夠檢測到Treg表達，其表達水平可在一定程度上反映機體的免疫狀況。但是，即使對于健康成人外周血的Treg水平，目前尚沒有進行大規模普查，不同作者報道的表達值不盡相同，Dieckmann〔4〕報道 CD4+CD25+T細胞占 CD4+T細胞的比例為 2.8% ～17.2%，Ichihara等〔5〕報道為 7.2%，Jonuleit等〔6〕報道0.7% ～5.5%。Baecher-Allan等〔7〕報道為 10%. 這些報道均存在檢測樣本量較少的缺點，其數值不能代表Treg的正常值，只能說明其大致范圍和相對變動情況。因為Treg可能隨內外環境變化而出現較大范圍的變動。為了解Treg在健康成人的外周血中表達情況，本文檢測了10例健康成人外周血的Treg表達率，結果Treg占CD4+T細胞的比例為(11.17±7.35)%，與其他研究者報道類似，說明本研究所得結果基本屬于正常表達范圍，可以作為深入研究的對照基礎。

大量的實驗證據表明，由CD4+CD25+Treg細胞介導的對自身反應性細胞的調節也是自身免疫耐受建立的重要機制之一。因此，可以推測CD4+CD25+Treg細胞在維持自身耐受的同時，也可以抑制腫瘤免疫的發生。研究表明，CD4+CD25+Treg細胞可以通過不同的機制抑制不同類型的細胞參與的腫瘤排斥反應。Shimizu〔8〕等證實去除CD4+CD25+Treg細胞可誘導對同源腫瘤細胞的免疫反應，也可以促進腫瘤病變部位的前炎癥反應，從而利于誘導對多種腫瘤抗原的免疫應答，證明了CD4+CD25+Treg細胞可以抑制體內抗腫瘤免疫反應。

Foxp3特異性地表達于Treg細胞，可作為Treg細胞的一個特異標志，而且調節著該類細胞的發育和功能。Foxp3是Treg細胞發育的一個關鍵轉錄因子。在人類Foxp3不僅可表達于CD4+CD25+T細胞〔9〕，還可表達于 CD8+CD28+T細胞(稱為抑制性T細胞)〔10〕。表達Foxp3的T細胞均具有免疫抑制作用，推測Foxp3的表達可能是導致這些細胞發揮其抑制作用的主要原因。

本研究結果發現漿液性囊腺癌患者和黏液性囊腺癌患者外周血CD4+CD25+Treg細胞數量明顯升高，并且外周血中Foxp3表達明顯增強，表明漿液性囊腺癌患者和黏液性囊腺癌患者CD4+CD25+Treg細胞不但數量增加，而且功能增強。因此，有利于腫瘤耐受的形成，降低免疫系統對腫瘤免疫應答，促進腫瘤的發生和發展。

CD4+CD25+Treg細胞通過細胞間接觸發揮抑制作用，另有研究認為該細胞能分泌免疫下調性細胞因子如TGF-β和IL-10等發揮免疫抑制功能，TGF-β1和 IL-10等細胞因子對CD4+CD25+Treg細胞的抑制功能有重要的作用，CD4+CD25+Treg細胞的接觸依賴抑制作用受 TGF-β1 和 IL-10 調節〔11，12〕。IL-10能協助幼稚T細胞分化成為調節性T細胞，抑制樹突細胞表達協同分子而間接抑制T細胞反應。而CD4+CD25+Treg細胞又可分泌IL-10，CD4+CD25+Treg細胞與IL-10間的正反饋調節可能促進免疫耐受。TGF-β1也是維持CD4+CD25+Treg細胞數量和功能的重要因子〔13〕，TGF-β1在體外可以誘導人外周血CD4+CD25+Treg細胞增生。一般認為CD4+CD25+Treg細胞膜表面結合的TGF-β1可能是細胞間相互作用的效應分子，抗TGF-β1單克隆抗體能明顯削弱CD4+CD25+Treg細胞調控T細胞的抑制功能。TGF-β1在早期抑制上皮性卵巢癌生長，但在晚期促進上皮性卵巢癌的生長和轉移〔14〕。TGF-β1和TGF-β3表達增強以及它們各自受體的缺失能促使腫瘤的產生和發展，使腫瘤更易復發，對化療藥物耐藥。血管生成在卵巢癌發展和轉移中是必不可少的，有研究發現TGF-β1陽性并伴有VEGF強陽性的血管密度明顯高于TGF-β1陰性、VEGF弱陽性的血管密度。可見TGF-β1與VEGF共表達能促進血管生成，從而有利于血管的生長。

本文證實上皮性卵巢癌患者外周血中免疫抑制性因子TGF-β1和IL-10均較正常對照組明顯增高。表明TGF-β1和IL-10與CD4+CD25+Treg細胞協同作用，引起免疫耐受，促進上皮性卵巢癌的生長和轉移具有重要的作用。綜上所述，CD4+CD25+Treg細胞是一種重要的具有免疫調節作用的T淋巴細胞，與免疫抑制性因子TGF-β1和IL-10協同作用，促進上皮性卵巢癌的進展和轉移。但其作用機制及CD4+CD25+Treg細胞與TGF-β1，IL-10的相互影響，還有待深入研究。

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3 Fontenot JD，Gavin MA，Rudensky AY，et al.Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells〔J〕.Nat Immunol，2003;4:330-6.

4 Dieckmann D，Plottner H，Berchtold S，et al.Ex vivo isolation and characterization of CD4+CD25+T cells with regulatory properties from human blood〔J〕.J Exp Med，2001;193(11):1303.

5 Ichihara F，Kono K，Takahashi A，et al.Increased populations of regulatory T cells in peripheral blood and tumor-infiltrating lymphocytes in patients with gastric and esophageal cancers〔J〕.Clin Cancer Res，2003;9(12):4404.

6 Jonuleit H，Schmitt E，Stassen M，et al.Identification and functional characterization of human CD4+CD25+T cells with regulatory properties isolated from peripheral blood〔J〕.J Exp Med，2001;193(11):1285.

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