代謝組學方法及其在中醫藥中的應用

鄭敏霞，沈 潔（浙江中醫藥大學附屬第一醫院，杭州市 310006）

從系統生物學的角度看，疾病是因蛋白質網絡和基因調節網絡被“擾動”而致，而中醫中的“證候”可能是蛋白質網絡和基因調節網絡被“擾動”后所發生的一種特異性變化狀態。這一被擾動網絡可通過其分泌到血液和尿液的內源性成分的改變而反映出來，而這種改變常以組、群、譜的特征出現。因此，反映中醫證候規律的“物質基礎”將可能是“組”、“群”、“譜”集成的形式[1]。

1 代謝組學概念

1.1 代謝組學定義

代謝組學是一門新興學科，指的是單個細胞、組織、器官或體液中所有小分子代謝物的集合，主要包括基因調控生物體在代謝過程中形成的中間產物和最終產物，即有機體內合成的代謝物便構成了代謝組，是關于生物體系內源代謝物質種類、數量及其變化規律的科學。它研究的是生物整體、系統或器官的內源性代謝物質及其與所受內在或外在因素影響的關系。常用的方法是檢測和量化一個生物整體代謝隨時間變化的規律，并對之進行編目；建立內在和外在因素影響下，代謝整體的變化軌跡，反映某種病理（生理）過程中所發生的一系列生物事件[2]。

1.2 代謝組學研究意義

與轉錄組學、蛋白質組學相比，代謝組學的優勢在于：①一切外源性刺激（如藥物、食品、環境等因素）都會促使生物體系進行調節并導致代謝組的變化，這種變化是生物過程的最終結果，生物體許多不能從轉錄組、蛋白質組體現出的變化可以通過代謝組體現；②代謝組學放大了基因和蛋白表達的微小變化，從而使檢測更容易；③代謝組學的研究不需建立全基因組測序及大量表達序列標簽（EST）的數據庫，且代謝物的種類要遠小于基因和蛋白的數目；④由于給定的代謝物在每個組織中都是一樣的，所以研究中采用的技術更為通用也更易被人們所接受[3]，正如Billy David所言：“基因組學和蛋白質組學告訴你可能發生什么，而代謝組學則告訴你已經發生了什么”[4]。

2 代謝組學分析技術

先進的分析檢測技術結合模式識別和專家系統等計算分析方法是代謝組學研究的基本方法。生物樣本中代謝物種類復雜，數目眾多，單一分析手段往往難以實現對樣本中全部代謝產物的測定。精確、靈敏、高通量的分析方法為代謝物分析提供化學手段，是代謝組學研究的基礎。各種常用的分離分析和不分離分析的手段都已經應用于代謝組學分析工作中，其中最常用的分析方法是1H核磁共振（1H-NMR）[5]和色譜（毛細管電泳）-質譜聯用[6]，這兩種方法各具特點，互為補充。

代謝組學是數據驅動的學科，各種模式識別的計算技術從大量的分析信號中發現有用知識或特征模式，是代謝組學研究的重要工具。海量數據要求適當的生物信息學方法進行有效信息的提取、噪聲信息的剔除等處理，最終達到能夠正確判斷或預測生物樣本的代謝模式，以及對具體代謝模式所對應的生物標志物（群）進行識別的目的。

3 代謝組學在中醫藥中的應用

代謝組學與中醫學在許多方面有相近的屬性，如果把它們有機的結合起來研究將是非常有意義的工作。代謝組學之父、英國倫敦帝國理工學院Jeremy Nicholson教授也認為人體應該作為一個完整的系統來研究，應用代謝組學和全面性系統策略來理解疾病過程，這與中醫的整體觀念和辨證論治思維方式不謀而合。

3.1 代謝組學與中醫辨證論治

代謝組學的研究通過對某一病證相關特定組分的共性加以分析、判斷，能夠幫助人們更好地理解病變過程及機體內物質的代謝途徑和代謝狀況，同時代謝組學還有助于發現疾病的生物標記物而達到輔助臨床診斷的目的。它能夠通過檢測不同時間患者的尿液或血液，對這些由疾病引起的代謝產物的響應進行分析，即代謝物組分析。其準確性依賴于儀器的性能，可以提高診治的科學化、定量化，避免人為因素的誤診。Zheng X等[7]采用氣相色譜-質譜（GC-MS）聯用結合模式識別的代謝組學方法研究了冠心病中醫臨床分型的體內物質基礎，其兩證型間的多個內源性代謝產物的含量存在明顯差異，且代謝組學的整體數據和標志物信息均顯示出兩證型冠心病的差異，提示代謝組學所研究的體內小分子化合物可能正是中醫分型的物質基礎。Lu YH等[8]采用GC-MS聯用法測定健康人和原發性高血壓病患者的血清內源性代謝物，結合主成分分析（PCA）和其偏最小乘方分析（PLS-DA），發現健康人和高血壓病患者血清代謝物譜有明顯的差異，利用馬氏距離（MD）分析可以清晰的區分3種中醫臨床證型的高血壓，同時還能顯示高血壓的發展過程。Li L等[9]應用NMR技術分析氣虛血瘀證鼠的尿液代謝物，發現模型組在甲酸鹽和肌酐等產物中與正常組存在差異。上海交通大學藥學院采用代謝組學研究，發現腎陽虛模型動物的代謝網絡明顯偏離正常組動物，而用溫陽中藥干預后，模型動物的代謝譜回歸至正常范圍，呈現網絡修復的結果[10]?！白C”的研究可以和處于科學前沿、綜合程度很強的系統生物學方法相結合，同時也是生命科學與臨床醫學的結合。這將把“證”的研究再次推向科學發展的前沿，成為中醫現代化最重要的研究方向之一。

3.2 代謝組學與中醫藏象理論

傳統醫學中的藏象學說就是研究內在的生命本質與外在現象的關系，揭示臟腑與形體諸竅、自然環境關系的學說。不同臟腑表現出來的生理現象是機體在不同環境下代謝結果的集中體現。換言之，藏象就是通過外在可見形象研究內在不可見事物的一種方法，這種研究方法與現代“黑箱理論”有相似之處[11]。代謝組學可以通過對“黑箱”外在的內源性代謝物的種類和數量的變化，與從疾病前兆到疾病發生、達到臨床診斷判定標準這一進程作相關性研究，可以獲得疾病前判定的科學依據，有利于對疾病進行預防和對預防效果的評價。例如偏頭痛的病因病機未明，一直以來有血管舒縮異常學說、神經機能障礙學說、三叉神經血管假說等，但是偏頭痛患者在先兆期和發病期都會出現前列腺素、神經肽等一系列內源性物質的異常[12]，代謝組學可以通過對這一系列的內源性物質的監控達到預防疾病的目的。

3.3 代謝組學與中藥方劑的整體療效

疾病是系統化、動態化、整體化的過程，在治療時應隨疾病的進程不同而調整藥物劑量，甚至藥物的種類，而以單一成分作用到單靶點的西藥對此束手無策，因為疾病發生的不同階段需要不同的藥物組分發揮調節作用，復方藥或多組分藥將在疾病治療中擔當重要角色。Wei YJ等[13]采用LC-ESI-MS法進行了復方丹參制劑體內代謝組學研究，分析測定了14種皂苷、13種酚酸和9種醌類化合物，而且檢測了口服該藥后鼠血漿、尿液和糞便中的53種代謝產物，包括30種原型化合物和23種轉化后的化合物，并且得到了復方丹參制劑中幾種成分的代謝途徑，揭示了該復方制劑的體內過程和活性物質基礎。四君子湯在臨床上可以治療腹瀉和便秘，這種可治療截然相反的兩個疾病的方劑使用在西醫里是不可思議的。其實中醫用它來主治脾胃氣虛證，而脾胃氣虛證可以理解成導致代謝網絡產生特定的損傷或破壞，這種損傷的兩個“極端”的結果就是腹瀉和便秘，四君子湯的使用一旦“方證對應”，就可以通過多種成分、多層次、多靶點地對“網絡性”損傷進行修復，從而達到治療疾?。ㄉ踔潦窍喾醇膊〉模┑男Ч?。中藥（尤其是復方）的整體性作用機制和療效在系統代謝組學的研究方法中，將可能得到充分的展示和挖掘。

3.4 代謝組學在中藥現代化方面的應用

植物代謝物是中藥的活性成分，其種類和含量隨品種、生長環境、采集季節以及炮制方法等因素而變化。因此，中藥的質量問題主要就是植物代謝組的問題，而藥理和毒理則是藥物對服藥者內分泌（代謝組）的影響。

3.4.1 代謝組學與中藥現代基礎研究 代謝組學研究可對各原料藥有效成分進行動態監測，從而克服采用不同原料藥材的中藥成品質量不穩定的弊端。同一藥材的多基源情況使中藥或中成藥品種多而復雜，成分極不穩定，最終影響成品中藥的標準化推廣[14]。Wang M等[15]研究了采摘時間對銀杏葉代謝產物的影響，在相同的條件（土壤、壓力和氣候條件）下，分別在清晨和晚上采摘銀杏葉，用甲醇提取葉中存在的代謝產物，如銀杏內酯、白果內酯和黃酮類物質，并用薄層色譜法分析。結果顯示，采摘時間雖只有一段時間的間隔，但其銀杏內酯和白果內酯的含量卻有較明顯的增長，不僅是含量高低而且代謝產物的組成數量也受采摘時間的影響，這種效應對黃酮類物質的影響最明顯。所以，應用代謝組學研究方法對道地藥材進行指紋圖譜水平鑒別，是嚴格控制中藥原藥材質量的關鍵技術環節之一。現代中藥系統研究的指導思想必須符合多成分、多靶點、整體調節的中醫藥基本思想，又能以現代技術進行有效的科學表征，建立基于代謝組學思想的化學分析平臺得出的中藥組分的各種指紋化圖譜（數據庫）[16]，并以此作為通用的準則搶占國際標準的制高點，這應是中藥現代研究的一個基本突破口。

3.4.2 代謝組學與中藥現代臨床研究 充分利用代謝組學技術建立新的中藥研發模式，其中心任務是建立考慮共生菌群代謝作用和CYP450代謝特性的新研發平臺，構建帶有人體菌群或代謝酶系的動物模型，實現宿主遺傳特性和菌群及酶系結構的標準化，通過對體液和組織的代謝組學特征開展研究，準確評價中藥的藥理藥效，建立相應的標準和操作規范，有助于臨床合理用藥和預防疾病，從而為中藥代謝機制和研發技術的標準化研究奠定基礎[17]。

中藥毒理涉及藥物毒性損害的劑量、藥效毒性安全比、毒性作用靶器官、毒性作用持續時間、積蓄毒性及藥物結構與毒性強弱關系、區別中藥自身原因引起的不良反應和非中藥自身原因引起的毒性反應等多項內容。以馬兜鈴酸引起的腎毒性為例，從病理研究結果來看，可能是馬兜鈴酸引起腎間質炎性細胞浸潤和成纖維細胞聚集，并分泌大量細胞基質所致。但這未能闡明馬兜鈴酸毒性的物質基礎，也就無法確定并去除毒性組分。而代謝組學卻能從整體圖譜水平上闡明中藥對機體所形成的內源性代謝影響和外源性代謝毒性影響，以及生物標志物的變化規律。劉霞等[18]采用1H-NMR代謝組學方法分析馬兜鈴酸Ⅰ誘導的雄性小鼠急性腎毒性。結果表明，馬兜鈴酸Ⅰ誘導的急性腎毒性主要來自給藥后抑制了小鼠體內的三羧酸循環和能量代謝，破壞了體內腸道菌群的生態平衡，改變了腎臟細胞內外的滲透壓，從而引起腎小管損傷。這項基于1H-NMR代謝組學方法的研究有可能為藥物的毒性機制研究提供新的思路。

3.4.3 運用代謝組學構建中藥標準研究模型的作用 代謝組學作為一種系統方法，能在鑒別和確證藥理與疾病模型上發揮作用。成功的疾病治療必須使代謝網絡中的缺陷部分正常化而不干擾其他維持健康所必須的代謝途徑的調控。代謝組學圖譜能全面反映代謝網絡途徑的大量化合物，區別不同種屬、不同品系動物模型的代謝狀態，鑒別人體疾病狀態的差異，尋找人類疾病、藥效和毒性的適宜動物模型，最終給出新藥的藥理藥效和人體毒理方面的綜合數據。

中藥作用機制的研究主要是研究藥物在代謝調控中所起的作用和如何起作用。這正符合了代謝組學全面而數學化的特點。體內藥物代謝的指紋圖譜，不僅可研究藥物本身的代謝變化，更重要的是可研究藥物引起的內源性代謝物的變化，從而直接反映體內生物化學過程和狀態的變化；并通過認識體液“代謝指紋圖譜”的變化，尋找或闡明藥物的作用靶點或受體。Wang P等[19]篩選和分析了當歸補血煎劑吸收入血的成分及其代謝產物，建立了代謝指紋圖譜，能夠快速篩選出多種活性成分和代謝產物，很好地解釋了當歸補血煎劑的作用機制。Li F等[20]采用超高效液相色譜-質譜結合多元統計分析方法對淫羊藿的藥效物質組學及其對氫化可的松誘導腎虛證大鼠的代謝物譜的影響進行了初步研究，通過比較正常組、模型組及淫羊藿醇提取物給藥組大鼠的血清和尿樣的代謝譜，發現淫羊藿苷和朝霍定C可能為淫羊藿的主要藥效物質基礎，進而對大鼠體內基礎代謝物譜、腎陽虛大鼠代謝物譜及給藥淫羊藿后大鼠體內代謝物譜進行比較研究，尋找與腎陽虛大鼠相關的生物標記物，發現淫羊藿可使腎陽虛大鼠網絡得以修復，由此探討了淫羊藿補腎的作用機制。目前，受體學說已經成為現代醫學科學的重要理論，在神經沖動傳遞過程中的化學遞質傳送研究中，應用代謝組學方法可測定給藥動物血清中多種內源性神經遞質（Ach、DA、NE、5-TH等）的動態變化，從代謝組分及體內代謝過程中代謝物含量變化的實時監測中發現具有療效的生物活性標志物，從中發現中藥的某些作用和起效機制[21]。

4 結語

如果能用整體性思路的代謝組學技術與中醫的整體觀念進行有效組合，一定能進一步加快中醫藥學研究的現代化進程。如果將系統生物學方法“導入”中醫的“證本質”及“藏象、病機”和復方中藥多層次、多靶點治療的協同性和方劑對應性的整體性研究領域，將有可能探索出循證中醫學研究的新方法與新途徑，有望在中醫藥基礎和臨床研究的思路與方法上有所創新，中醫藥與以代謝組學為核心的系統生物學的結合將是一個極富創造性，并可能引領中醫藥現代化的重要之舉。

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