蟾酥提取物微球制備及含量的測(cè)定

蘇麗英 劉國(guó)實(shí) 張澤兵 周小洲 王 瀾 韓 冰 才子斌

(武警吉林省總隊(duì)醫(yī)院口腔科，吉林 長(zhǎng)春 130061)

聚乳酸-羥基乙酸共聚物〔Poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA〕是近幾年來(lái)常被應(yīng)用于控釋、緩釋給藥系統(tǒng)的載體材料。微球(microspheres)是一種藥物包裹于適宜的高分子材料或吸附于適宜的載體材料而制備的類(lèi)球狀或球狀的微粒。蟾酥(Bufobufo gargarizans C antor)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥，其性溫，味甘辛，有毒;具有消腫、止痛、開(kāi)竅、醒神、解毒、強(qiáng)心等效用〔1〕。蟾酥中含有多種有效的化學(xué)成分，包括蟾毒色胺類(lèi)和蟾毒配基類(lèi)化合物，以及從蟾蜍中分離而得到的腎上腺素、嗎啡、多糖類(lèi)和蝶啶類(lèi)等化合物〔2〕。近幾年來(lái)臨床醫(yī)學(xué)和藥學(xué)的進(jìn)一步研究表明蟾酥還具有抗腫瘤、抗老年癡呆、降血壓、抗炎和麻醉等多種藥理學(xué)作用〔3〕。在PLGA中將蟾蜍的提取物包裹于其中而制備成微球。這種微球是具有長(zhǎng)效作用機(jī)制的貯庫(kù)式的可生物降解的微球，不僅能夠明顯地提高患者的耐受性和依從性，同時(shí)也能夠提高藥物的生物利用度和生物學(xué)穩(wěn)定性。

1 資料與方法

1.1 材料 蟾酥購(gòu)于吉林大藥房(經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院鑒定為蟾酥Bufobufo gargarizans C antor)。蟾毒靈對(duì)照品，華蟾毒配基對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SHIMADZU LC-10AVP高效液相色譜儀(日本)，AB204-N電子天平(Mettler公司)。所用化學(xué)試劑均為分析純(北京化學(xué)試劑廠)。

1.2 方法

1.2.1 采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備蟾酥提取物蟾毒靈和華蟾毒配基微球 精密稱(chēng)取蟾酥提取物蟾毒靈和華蟾配基200 mg，將其溶于水制備成溶液。向濃度范圍25%～32%的PLGA的二氯甲烷的溶液中，加入濃度為1 200%～1 800%的蟾毒靈和華蟾毒配基的高濃度的水溶液，將其進(jìn)行高速攪拌從而制成油包水的初乳，向溶有濃度為0.9% ～1.1%的PVA的0℃的水溶液中緩慢注入前述已制備好的初乳。使用自制復(fù)乳攪拌反應(yīng)器進(jìn)行高轉(zhuǎn)速攪拌，從而形成水包油包水的復(fù)乳。再以低轉(zhuǎn)速攪拌，利用真空泵在攪拌期間向反應(yīng)器中進(jìn)氣，同時(shí)在反應(yīng)器內(nèi)使用抽風(fēng)機(jī)由內(nèi)向外排氣，3 h之后即可得到固化的微球。用蒸餾水將所得微球沖洗5次，再使用輔料溶劑(7%甘露醇和1%羧甲基纖維素鈉)將所得微球繼續(xù)沖洗2次。微球粉末是微球中加入50 ml的輔料溶劑，再經(jīng)冷凍干燥而制得。將凍干的微球粉末通過(guò)濾網(wǎng) (154 μm)，在4℃環(huán)境中保存。

1.2.2 微球形態(tài)學(xué)測(cè)定及蟾酥提取物蟾毒靈和華蟾毒配基的PLGA微球包封率的測(cè)定 將蟾酥的提取物蟾毒靈及華蟾毒配基的PLGA微球 (制備后未加其他輔料)混勻后，在離心管中加入二氯甲烷2 ml以溶解精密稱(chēng)取的30 mg蟾酥的提取物蟾毒靈和華蟾毒配基的PLGA微球，將管口密封，待二氯甲烷溶解微球后，再將醋酸緩沖液1 ml滴加于管中，將管口密封，在振蕩器上將離心管振蕩10 min，在低速離心機(jī)上調(diào)整轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，將離心管離心10 min。向另一支試管中加入吸取的上層清液，以及醋酸緩沖液1 ml，將管口密封，將試管在振蕩器上振蕩，再在離心機(jī)上離心，吸取上層清液再置于另一試管中。將上述操作重復(fù)6次，最后將水加入至試管中定容至6 ml，應(yīng)用高效液相色譜法檢測(cè)需量取70 μl，從而折算包封率。蟾酥的提取物蟾毒靈及華蟾毒配基的微球稱(chēng)取30 mg以進(jìn)行粒徑檢測(cè)，并通過(guò)電鏡及顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)的觀察。

1.2.3 色譜條件 為檢測(cè)在微球中蟾毒靈和華蟾毒配基的含量，利用高效液相色譜對(duì)有機(jī)試劑萃取后的溶液進(jìn)行檢測(cè)，ODSC18柱 (250×4.6 mm，5 cm);檢測(cè)波長(zhǎng):296 nm;流動(dòng)相:乙腈∶0.5%磷酸二氫鉀 (KH2PO4)溶液為32∶68(用磷酸調(diào)pH3.2);流速為1 ml/min;柱溫:40℃;理論板數(shù)按蟾毒靈色譜峰、華蟾毒配基色譜峰計(jì)算均不應(yīng)低于4 000。

1.2.4 制備供試品溶液 取約0.2 g的待測(cè)樣品，精密稱(chēng)定，加入精密量取的40 ml甲醇，將其重量精密稱(chēng)定，加熱回流2 h，冷卻至室溫，再稱(chēng)其重量，為補(bǔ)足減失的重量向其中加適量甲醇，混勻。過(guò)濾 (0.45 μm微孔濾膜)后，供試品溶液即為其中10 ml的續(xù)濾液。分別取供試品溶液、蟾毒靈溶液、華蟾毒配基溶液注入液相色譜儀中，測(cè)定、記錄蟾毒靈和華蟾毒配基的保留時(shí)間分別為113 min和106 min，理論板數(shù)按蟾毒靈峰計(jì)算為4 000，按華蟾毒配基峰計(jì)算為4 100〔4～6〕。其他峰和蟾毒靈峰、華蟾毒配基峰的分離度 ＞1.5。

2 結(jié)果

蟾毒靈和華蟾毒配基的PLGA微球制劑呈粉末狀，白色，微球?yàn)橹旅堋A整的球狀，既無(wú)萎縮也無(wú)塌陷的現(xiàn)象。其中制備微球粒徑大小適宜，經(jīng)測(cè)量其范圍200 nm～10 μm。微球制劑的包封率較高，該微球制劑的包封率經(jīng)測(cè)量可達(dá)70%以上。為滿足肌肉注射的要求其粒徑大小、包封率均符合要求。

為保證峰面積與進(jìn)樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，蟾毒靈的進(jìn)樣量范圍為0.206～1.03 g。每間隔4 h測(cè)定同一供試品溶液一次，分別測(cè)定、記錄蟾毒靈與華蟾毒配基的峰面積，再分別計(jì)算出兩者的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示兩者RSD值均不大于3%，符合規(guī)定要求。同一批樣品取6份，依前述的方法進(jìn)行平行試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果表明兩者的重現(xiàn)性較好。為考察其穩(wěn)定性，同一供試品溶液等體積量取6份，分別放置4、8、12、16、20、24 h后進(jìn)樣，分別測(cè)定、記錄蟾毒靈與華蟾毒配基的含量。測(cè)定結(jié)果顯示兩者的RSD值均不大于3%。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明至少在24 h內(nèi)供試品溶液性質(zhì)穩(wěn)定。

3 討論

目前制備藥物PLGA微球最常用的工藝是復(fù)乳攪拌揮發(fā)法，由于蟾毒靈與華蟾毒配基兩個(gè)蟾酥提取物易溶于水，因此本文制備蟾毒靈與華蟾毒配基的蟾酥提取物微球采用w/o/w的方法。復(fù)乳攪拌揮發(fā)法的優(yōu)點(diǎn)是技術(shù)路線簡(jiǎn)單易行，但是缺點(diǎn)是影響制備工藝的因素較多，其中包括油水的比例、PLGA的濃度、初乳及復(fù)乳的速度、內(nèi)水相的體積以及攪拌裝置等。在蟾酥提取物蟾毒靈與華蟾毒配基微球的制備中諾華制藥采用的是噴霧干燥法。干燥法制備的微球優(yōu)點(diǎn)是均一性良好，能夠一步成球，微球無(wú)需再進(jìn)行后處理，適合較大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn);然而經(jīng)復(fù)乳攪拌揮發(fā)法制備的蟾毒靈和華蟾毒配基的蟾酥提取物微球的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在藥物的釋放上。將工藝參數(shù)控制好，并保證操作無(wú)菌，復(fù)乳攪拌揮發(fā)法同樣能夠放大生產(chǎn)。

由于蟾酥中成分的組成及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，迄今為止對(duì)蟾酥中包含的所有成分尚未研究明確，現(xiàn)有研究成果顯示蟾酥中約20%是脂溶性成分，其中主要為蟾蜍毒素類(lèi)包括蟾毒配基類(lèi)及其酯〔7〕。蟾毒配基類(lèi) (bu fogeinins)一般是蟾蜍毒素類(lèi)化合物等原成分經(jīng)過(guò)提取或者干燥加工過(guò)程分解而得到的，其原因可能是蟾蜍毒素在蟾酥的炮制及加工過(guò)程中分解而成。蟾毒配基類(lèi)的種類(lèi)約有20多種，其中主要包括華蟾毒配基、脂蟾毒配基、蟾毒靈、遠(yuǎn)華蟾毒精、日蟾毒它靈、蟾毒它靈等化合物。隨著對(duì)蟾酥的臨床作用、藥理學(xué)及藥效學(xué)研究的不斷深入，眾多學(xué)者日益重視和研究提取分離蟾酥中的有效成分。本文系統(tǒng)地研究了蟾毒靈和華蟾毒配基這兩個(gè)的蟾酥中有效成分的含量，并為緩控釋制劑的應(yīng)用而制備相應(yīng)的微球，為蟾酥中有效成分蟾毒靈和華蟾毒配基在微球制劑的檢測(cè)以及蟾酥在臨床應(yīng)用、藥理學(xué)和藥效學(xué)等方面的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為研制和開(kāi)發(fā)蟾酥相關(guān)的緩控釋制劑提供了實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。

1 蘇永華，牛 欣.蟾酥制劑的藥效作用研究評(píng)述〔J〕.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001;24(2):51-4.

2 劉 冬，杜守穎，何秀峰，等.蟾酥中3種脂溶性有效成分提取工藝及含量測(cè)定方法〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011;17(3):69-72.

3 曹徐濤.蟾皮的化學(xué)成分研究〔D〕.沈陽(yáng)藥科大學(xué)碩士論文，2009;10(S1).

4 劉 丹，奉建芳.蟾酥中3種蟾毒配基組合物的表觀溶解度和表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定〔J〕.中國(guó)中藥雜志，2008;33(11):1256-8.

5 鈕亞珍，薛貴平.蟾酥的藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.張家口醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002;19(3):58-9.

6 王浩天，王 爽，王海龍.蟾酥提取物華蟾毒配基和蟾毒靈含量測(cè)定〔J〕.人參研究，2008;1:29-31.

7 劉吉華，王靜蓉，余伯陽(yáng).反相高效液相色譜法測(cè)定蟾酥中的3種蟾毒內(nèi)酯〔J〕.色譜，2008;26(2):186-8.