皮膚微透析技術在藥動學及藥效學研究中的應用進展Δ

李靜雅，朱 丹，劉建勛，林 力#（.中央民族大學中國少數民族傳統醫學研究院，北京市 0008；.中國中醫科學院西苑醫院，北京市 0009）

微透析（Microdialysis，MD）是20世紀60年代在對動物腦內的游離氨基酸和神經遞質的研究中提出的概念[1]，20世紀70年代發明MD探針后，MD技術廣泛應用于神經藥理學，并逐漸擴展到血液及多種器官和組織的研究中。20世紀90年代初期，MD技術開始應用于皮膚藥理學的研究，最初是由Anderson等[2]用于人真皮內乙醇含量測定，此后，皮膚微透析（Dermal microdialysis，DMD）廣泛應用于皮膚病生理學、皮膚藥動/藥效學和皮膚毒理學研究。本文現就近年DMD技術在藥動學和藥效學研究中的應用進展進行簡要綜述。

1 概述

DMD技術是通過平行埋植于真皮層或皮下組織層的線性探針（Linear probe）以及探針中灌流的生理性溶液，使皮下內源或外源性物質以一定的比例順濃度梯度透過探針的半透膜進入透析液中。在一定的流速下，按一定時間間隔對透析液進行采集并分析，從而可通過透析液的濃度估算真皮層或皮下組織中特定成分的濃度變化，不需要損失體液或破壞組織，可以進行活體皮膚的實時檢測，因此MD采樣法適合于藥物經時變化的檢測。

皮膚是人體最大的器官，具有特殊的屏障功能和生理特點，經皮給藥系統（TDS）能夠改善患者用藥的順應性并發揮局部起效優勢，因此研究藥物在皮膚的滲透、吸收、代謝以及起效機制對于經皮藥物的設計和評價有重要意義。但是傳統的皮膚藥理學研究方法如膠帶剝離法、活組織檢查法等需要破壞皮膚組織，不能真實反映正常皮膚的通透特性，對皮下組織的游離藥物和結合性藥物也無選擇性；而離體皮膚滲透實驗不能代替在體皮膚研究。相較之下，DMD技術能進行在體原位檢測，對皮膚破壞小；可選擇性地采集非結合性藥物；可同時在多位點進行采樣，因此DMD成為少數適合于研究皮膚藥動學進而評價經皮制劑生物利用度和生物等效性的研究方法之一[3]。與此同時，DMD具有能同時采集外源性和內源性化合物的特點，因此近年來，該技術在皮膚病生理機制及藥效機制研究領域發揮著重要的作用，被廣泛應用于皮膚炎癥、皮下微循環機制以及局部抗炎藥物藥效研究中。

2 皮膚藥動學研究

2.1 透皮吸收的研究

經皮給藥發揮藥效的關鍵問題之一是藥物的透皮吸收速率和程度，也是評價外用制劑的重要方面。與其他的皮膚藥動學研究方法相比，DMD技術能夠更靈敏地反映出藥物透皮吸收的實時特性，并且能夠比較藥物在不同部位的滲透和吸收差異，因此在藥物的透皮特征的研究中應用廣泛[4]。近年來，隨著各種透皮促進技術和方法，如離子導入技術、微針技術的發展，利用DMD考察這些技術透皮促進效率的報道不斷增多[5～8]。近年研究表明，阿米替林具有局部止痛的作用[9]，Patel等[5]給兔去毛皮膚給予阿米替林，分別以100、200、300 μA·cm－2的強度進行離子導入處理60 min，以DMD聯合高效液相色譜（HPLC）法測定給藥部位皮下藥物濃度，并測定其血藥濃度，3個強度下的離子導入后，皮下藥-時曲線下面積（AUC）分別為（19±7）、（119±56）、（615±302）mg·min·L－1，而血藥濃度始終低于檢測限，表明離子導入技術能促進阿米替林的局部皮膚滲透，且入血量極低，從而降低藥物進入循環系統對中樞神經產生的作用。Shukla等[6]研究阿昔洛韋不同輔料配方的半固體制劑在兔皮膚的吸收差異，配合離子導入法分別給予中性軟膏和pH11的堿性凝膠劑，結果表明pH11的凝膠劑在真皮層的吸收量顯著高于中性半固體制劑。

DMD技術的優勢之一就是能夠進行在體采樣，并保持皮膚結構的完整性，因此與傳統皮膚藥動學采樣方法相比，準確性更高。DMD還可多位點的植入，從而可以對同一種制劑在正常皮膚與患病皮膚的滲透吸收特性進行比較。Ortiz等[10]分別以DMD和膠帶剝離采樣法測定患刺激性皮炎處皮膚對甲硝唑的滲透性，結果表明DMD法取樣患病處皮下藥物濃度為正常皮膚的3倍，而膠帶剝離取得的樣品測得結果相反；之后，又以此2種方法比較了遺傳過敏性皮炎與正常皮膚對甲硝唑乳膏劑的吸收[11]，DMD取樣法顯示患病皮膚的藥物濃度為正常皮膚的2～4倍，而膠帶剝離樣品濃度結果差異無統計學意義。由此認為取樣方法的選擇直接影響藥物透皮吸收的測定結果，而DMD法能夠用于此類研究中。

2.2 生物利用度（Bioavailability，BA）和生物等效性（Bioequivalence，BE）評價

BA和BE反映了藥劑的有效成分釋放進入血液循環，進而到達起效部位的速率和程度，是以藥動學參數評價制劑質量或新劑型可行性的重要指標。理想的經皮給藥局部起效制劑，要求能夠在給藥部位迅速地吸收和處置，但進入血液循環的藥量不能過高。目前，能夠用于皮膚給藥制劑生物等效性評價的研究方法非常有限，而DMD技術微創、實時的特點使其成為BA/BE研究的理想工具。Tettey-Amlalo等[12]對18名受試者給予酮洛芬凝膠劑并進行DMD取樣，分析DMD技術用于BE評價的可行性，認為DMD取樣難以得到準確的峰濃度（cmax）數據，可以藥-時曲線下面積（AUC）作為評價指標。Mathy等[13]以皮下和血液雙位點微透析取樣的方法，研究并比較靜脈注射劑和皮膚凝膠2種劑型的氟康唑在大鼠皮膚和血漿中的藥動學參數。結果表明，按10 mg·kg－1靜脈注射給藥后，氟康唑迅速滲透進入皮膚，血液與真皮游離藥物濃度-時間曲線相近，AUC分別為（5 985.1±192.3）、（5 943.9±200.0）μg·min·mL－1。而皮膚局部給予氟康唑凝膠0.5 g后，AUC0～674h為（271.7±28.4）μg·min·mL－1，cmax達到（637.1±177.8）ng·mL－1，超過最低抑菌濃度（MIC 0.25～0.5 μg·mL－1）。Brunner等[14]對一種新型雙氯芬酸噴霧凝膠經皮給藥后的血藥濃度、皮下組織和骨骼肌分布與雙氫芬酸鈉口服制劑進行比較，以DMD測定皮下脂肪的藥物濃度，結果表明凝膠劑的相對生物利用度皮下和骨骼肌分別為口服用藥的344%和209%，而血藥濃度僅為口服給藥的50%，認為新劑型具有良好的局部滲透性和較低的系統分布，可以作為口服制劑的替代劑型用于軟組織炎癥的治療。

重現性較差是DMD目前還沒有很好解決的一個問題，這是影響BE評價結果準確性的主要因素[3]。可能造成DMD樣品差異性的原因主要有2方面：受試個體的皮膚通透性差異以及探針埋入操作的穩定性。探針的埋入深度不同會影響樣品濃度，但通過反復練習并配合超聲掃描檢測則可以提高埋入深度的穩定性[15]。Tettery-Amlalo的試驗驗證了熟練的操作人員在人體前臂埋入探針所產生的細小深度差別與AUC的差異無相關性。而個體差異性的問題可以通過增加樣本量的方法加以校正。Garcia等[16]在研究甲硝唑的BE中，選取14名受試者進行DMD取樣，發現DMD樣品的差異性影響試驗結果。Benfeldt等[17]則認為BE研究的樣本量至少應在18人以上，并且建議配合無創性的檢測手段對皮膚溫度、表皮水分流失量和皮下血液循環進行評估，以分析皮膚功能和通透性的個體差異。

2.3 系統給藥的皮膚分布考察

DMD技術應用于系統給藥的藥動學研究具有以下意義：以皮膚或局部軟組織為靶器官的藥物，可以對其皮膚藥物濃度進行評價及對藥物的皮膚副作用進行研究。Traunmuller等[18]比較了患糖尿病并發足感染患者靜脈注射利奈唑胺600 mg后，健康皮膚、發炎皮下組織和骨松質中的藥動學參數，cmax分別為（15.5±2.5）、（15.8±2.8）、（15.1±4.1）mg·L－1，認為此濃度下可有效抑制外周軟組織感染。Traunmuller等[19]所做的另一個關于克拉霉素在皮下脂肪組織的藥動學特性研究中，選擇6名健康受試者，以每日2次、每次500 mg的劑量口服克拉霉素，達到穩態血藥濃度之后測定皮下組織中的藥物濃度，結果表明皮下藥物濃度AUC0～24h為（0.84±0.19）mg·h·L－1，與血液中的AUC的比為（0.39±0.04），認為此劑量不能達到治療皮膚和軟組織感染的有效濃度。

DMD采樣可以反映皮下藥物濃度經時變化，因此近年來有研究驗證并建立以DMD的濃度-時間特征反映體內血藥濃度變化，或反之根據血藥濃度預測皮下濃度。Engleman等[20]提出并驗證以皮膚乙醇濃度-時間變化表征飲酒者體內酒精含量的方法：選擇成年Wistar大鼠和嗜酒大鼠作為研究對象。首先，給大鼠腹腔注射劑量依次為0.5、1.0、2.0 g·kg－1的乙醇，結果測得其皮下DMD樣品濃度在15 min達到最大值，分別為70、123、203 mg；然后，分別以灌胃和腹腔注射的方式，以1.0 g·kg－1的劑量給予大鼠乙醇，比較血液乙醇濃度-時間曲線與皮下DMD樣品濃度-時間曲線，認為兩者具有相關性。Shukla等[21]分別給兔靜脈注射阿莫西林和頭孢呋辛，DMD取樣測定皮下藥物濃度，并同時測定血藥濃度，計算血液-皮下藥物分布常數Kin（血藥濃度/皮下濃度）和Kout（皮下濃度/血藥濃度），通過此分布常數建立以血藥濃度預測皮下藥物濃度的方法，并與DMD實際測得的結果進行比較，結果表明根據該方法所預測的藥物濃度與實際濃度接近。

3 藥效學及其機制研究

選擇不同分子截留值（Cut-off）的探針，可以選擇性地提取不同分子量大小的成分，較小的截留值可用于測定藥物濃度，而選擇大截留值的探針可以采集內源性物質，因此DMD法可以用于檢測皮下某些生物標記物，從而對皮膚病生理及藥效學機制進行研究。目前DMD主要用于皮膚炎癥機制和皮膚局部血液循環調控機制的研究。近年來有報道對如腫瘤壞死因子（TNF）-α、IL-1、IL-6、IL-8、前列腺素（PG）、異前列腺素F（2）-IsoPs、組胺等炎癥因子[22～26]進行MD取樣，從而可以對外用局部抗炎藥的藥效學進行評價。Shinkai等[27]用巴豆油建立大鼠皮膚炎癥模型，皮下埋入MD探針后，給予聯苯乙酸貼劑，測定MD樣品的藥物濃度的同時，對其中PG-E2水平進行測定，結果表明，巴豆油能顯著升高皮下PG-E2水平，而在給予0.5%或3.5%聯苯乙酸貼劑2～5 h后PG-E2水平顯著下降。在Shinkai等[28]的另一項研究中，證明酮洛芬經皮給藥能夠顯著降低皮膚和關節液的PG-E2含量。Brazis等[29]研究環孢菌素A對比格犬皮膚組胺和PG-D2水平的影響，結果表明組胺水平在治療15～30 d之后顯著下降，但PG-D2水平無顯著變化，說明環孢素A是通過抑制組胺釋放發揮抗炎作用的。皮膚病生理機制研究也是DMD的主要應用領域。配合激光多普勒血流測定，同時以DMD作為采樣和給藥的方式，可以對皮膚局部血流的機制通路進行驗證。比如Hubing等[30]在人前臂埋入MD探針后，分別向其中灌流含有PG抑制劑酮咯酸、一氧化氮（NO）合成酶抑制劑L-精氨酸甲酯和空白生理鹽水溶液，從而驗證皮膚潮紅部位的血管擴張調節與PG以及NO的關系。

4 結語

DMD技術不斷發展并被廣泛應用，促進了皮膚藥理學的深入研究以及經皮給藥系統的發展，但此技術仍有不足之處。首先，是重現性較差的問題，埋入深度和持續時間以及皮膚的差異會影響重現性，這些因素與探針提取率之間的關系是DMD方法學研究中的重點之一。目前在深度與回收率差異的相關性問題上還存在爭議，需要進一步研究證明。其次，DMD對親脂性藥物和高蛋白結合率的藥物不敏感，雖有文獻報道[31]向灌流液中加入白蛋白可對結合型藥物進行提取，但樣品中引入的蛋白質需要預處理，因此親脂性藥物的提取方法需要優化。再次，埋入探針會誘發局部炎癥和排異反應，使得取樣持續時間受到限制，對皮膚炎癥的研究也會產生一定影響。因而，如何改進DMD試驗方法以降低炎癥對試驗結果的影響也是今后的研究重點。

在中醫藥領域，DMD的應用還不夠廣泛，主要是中藥經皮給藥新型制劑的吸收分布研究，如青藤堿的皮膚藥物含量和藥動學參數測定[32]、葛根素皮下含量的測定[33]等。近年來脂質體制備技術日趨發展，多用于局部經皮給藥制劑，具有增加難溶性藥物溶出、增強皮膚靶向性、增加藥物在皮膚局部蓄積以及持續釋放藥物的特點，是經皮給藥制劑的理想載體[34]。利用脂質體技術開發中藥新制劑目前已有報道，凌家俊等[35]利用MD技術研究比較青藤堿脂質體貼劑與普通貼劑的藥動學特性，認為脂質體貼劑具有更高的生物利用度且具有貯庫效應。中藥雖對多種病癥療效確切，但中藥本身成分復雜，很難對其起效機制和代謝過程進行研究。近年來利用MD技術進行藥動/藥效學研究的方法日趨成熟，可以將這一思路引入中醫藥研究。DMD創傷小、患者順應性好，近年國外有大量關于DMD臨床試驗的報道，可以將DMD應用于中藥臨床研究，從而為闡明藥效學機制以及中藥新劑型的質量評價提供依據。

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