假肥大型肌營養不良患者骨骼肌纖維再生病理特點研究

趙清石 鞠浩 劉海燕 劉川 李海平

假肥大肌營養不良是一組因肌肉缺乏抗肌萎縮蛋白，引起的進行性肌肉變性疾病，為X連鎖隱性遺傳，分為杜興型肌營養不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝克型肌營養不良（Becker muscular dystrophy，BMD）[1]。主要表現為緩慢進行性加重的對稱性骨骼肌萎縮和無力，最終完全喪失運動功能。其病理以肌纖維的變性、壞死和再生為主要表現[2]。其發病機制雖得到公認，但對于該病尚無有效的治療方法。研究該病肌纖維再生特點，探索肌纖維再生的相關因素具有重大意義。本實驗收集1998～2008年間臨床及病理診斷明確假肥大型肌營養不良患者骨骼肌標本25例，研究其肌纖維再生特點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 假肥大型性肌營養不良25例，其中DMD18例、BMD7例。DMD患者按年齡分為三組：3～6歲組、7～8歲組、9～13歲組，每組6例。再生肌纖維用NCAM標記，觀察各組年齡、病程及再生肌纖維個數。肌營養不良的診斷均確立在臨床、病理及實驗室檢查基礎之上[1]。

1.2 方法

1.2.1 標本獲得 2％利多卡因局部麻醉，肱二頭肌開放式骨骼肌活檢。

1.2.2 標本處理 液氮/異戊烷冷凍，7μm連續冰凍切片。

1.2.3 組織化學及免疫組織化學染色分析 組化為HE染色，觀察再生肌纖維特點。

免疫組化采用ABC免疫組織化學染色。試劑包括鼠抗人NCAM單克隆抗體（1∶50，美國 Santa Cruz Biotechnology公司產品）；動物血清（馬血清，中美合資蘭州民生海洋生物有限公司）；ABC試劑盒（美國Vector Laboratories公司產品）。

1.2.4 形態計量學分析 200倍光學顯微鏡下完成對再生肌纖維的定量，每個活檢標本至少有兩張切片參加計數，每張切片再生肌纖維數量的評估至少在6個顯微鏡視野內完成，以每單位視野面積中NCAM陽性肌纖維數表示再生肌纖維（fibers／200倍視野），應用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統版本9.0，通過圖像分析和計算測得再生肌纖維面積、直徑。以獲得數據為基礎，得出再生肌纖維平均直徑、平均面積情況。

表1 NCAM染色下神經肌肉疾病再生肌纖維形態定量分析

表2 DMD患者年齡分組（NCAM標記再生肌纖維）

表3 DMD患者年齡分組再生肌纖維統計表

圖1 DMD HE染色×200

圖2 DMD NCAM染色×200

1.2.6 統計學方法每個標本的再生肌纖維值取其各個顯微鏡視野平均值。各組數據以均數±標準差（x±s）表示。采用SPSS11.0統計軟件進行統計學分析：用單因素方差分析（ANOVA）進行多組間均數比較，組內均數兩兩比較用方差分析進行多重比較（q檢驗）。

2 結果

2.1 再生肌纖維病理特點 在HE染色中，DMD患者骨骼肌肌纖維大小不等，可見大量變性、壞死和再生肌纖維，壞死呈灶性分布，結締組織增生。BMD病理改變較DMD輕，變性、壞死和再生散在，結締組織不同程度增生。NCAM作為再生肌纖維的標記物，通過HE染色和抗NCAM單克隆抗體染色同源纖維比較，觀察到HE染色下再生肌纖維深染，胞質嗜堿性深染，細胞核大；NCAM染色可見再生纖維越幼稚，染色越深，晚期再生染色淺，成熟肌纖維、炎性細胞和結締組織均不著色（圖1、2）。假肥大型肌營養不良再生肌纖維形態基本相同，但是肌纖維再生活躍程度不同：DMD再生活躍，發病年齡均較小；BMD再生不活躍，且年齡偏大，肌纖維直徑大。

2.2 再生肌纖維形態計量學分析 使用光學顯微鏡在200倍下觀察，對活檢標本進行計數，每個標本至少選取兩張切片，每張切片至少選取6個顯微鏡視野進行再生肌纖維數量的評估，以每單位視野面積中NCAM陽性肌纖維數表示再生肌纖維（fibers／200倍視野），應用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報告分析系統版本9.0，通過圖像分析和計算測得再生肌纖維平均面積、平均周長和平均直徑（表1）。可見BMD患者再生肌纖維明顯大于DMD患者再生肌纖維（表2）。DMD患者隨年齡增長再生肌纖維數量逐漸減少（表3）。

3 討論

骨骼肌纖維在受到化學、物理及機械損傷時具有旺盛的再生能力，研究肌纖維再生過程、肌纖維再生的相關因素是解決肌病基本特別是肌營養不良治療的重要手段[3]。假肥大型肌營養不良是一組遺傳性疾病，兒童早期起病，迄今尚無有效治療手段。對于假肥大肌營養不良，特別是DMD，大量實驗發現其再生活躍，因此探索其再生特點，尋找促進其肌纖維再生、成熟的因素具有重大價值。

本研究可見假肥大型肌營養不良再生肌纖維形態基本相同，但是肌纖維再生活躍程度不同。DMD患者普遍年齡較小，骨骼肌病理發現其再生較活躍。BMD患者年齡多較DMD偏大，再生活躍程度較DMD差。同時本研究表明DMD患者骨骼肌纖維再生隨年齡增長再生亦逐漸減弱。國外研究表明[4]，正常情況下，哺乳動物骨骼肌有很好的自我修復能力，都會隨著衰老而發生萎縮，這可能是常年正常使用時引發的損傷未能及時修復的積累結果。隨著年齡的增加，損傷后肌肉的再生能力也將降低，肌肉正常再生能力跟不上過度受損的速度，導致出現肌肉的無力及萎縮，這可能與肌衛星細胞數目減少和（或）增殖能力的減弱有關。有研究表明，在再生中起重要作用的衛星細胞數量在肌病患者1歲左右開始增加，3～9歲達高峰[5]。本實驗發現DMD患者8歲前再生較8歲后明顯活躍，可能由于肌衛星細胞的增殖分化，不能彌補肌營養不良患者肌肉修復過程中由于不斷激活而導致的衛星細胞池的衰竭。在DMD患者中，衛星細胞增殖加強的地方，端粒（細胞反應年齡的指示器）的長度與正常老年人一樣都過早縮短。而且，在動物模型中，隨著年齡的增長或重復的再生，衛星細胞的增殖潛能減弱[6]。因此可以解釋我們的實驗中，在年齡小的患者的肌纖維再生較年齡大者活躍。因此假肥大型肌營養不良易及早治療，早期促進肌纖維再生，減少肌纖維變性、壞死具有重大意義，當達到一定年齡后肌衛星細胞池耗竭時，再行治療在某種程度上來講意義不大。

[1]沈定國.肌肉疾病[M].北京：人民軍醫出版社,2007：214-218.

[2]吳世文,馬維婭譯.臨床肌肉病理學[M].3版.北京：人民軍醫出版社,2007：40-50.

[3]Grefte S，Kuijpers-Jagtman AM，Torensma R，et al.Skeletal muscle development and regeneration[J].Stem Cells Dev，2007，16（5）：857-868.

[4]Buricchi F，Chiarugi P，Fiaschi T，et al.During muscle ageing the activation of the mitogenic signalling is not sufficient to guarantee cellular duplication[J].Biochem,2005，54：258.

[5]Edstr m E，Altun M，Bergman E，et al.Factors contributing to neuromuscular impairment and sarcopenia during aging[J].Physiol Behav,2007,92（1-2）：129-135.

[6]Boncompagni S，Kern H，Rossini K，et al.Structural differentiation of skeletal muscle fibers in the absence of innervation in humans[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2007，104（49）：19339-19344.