甲型H1N1流感血清流行病學(xué)研究進展

鄭奎城,沈曉娜,楊式芹,林元波,周朝暉,謝劍鋒,陳 煒,翁育偉,嚴(yán)延生

2.福建醫(yī)科大學(xué),福州 350004;

3.福建省實驗動物質(zhì)量檢測中心重點實驗室,福州350001

甲型H1N1流感(甲流)病毒是4源重配病毒,由經(jīng)典豬流感病毒、歐洲豬流感病毒、禽流感病毒和人流感病毒重配而成,人群對甲流病毒普遍易感。2009年6月11日,世界衛(wèi)生組織(WHO)宣布將甲流流行警告級別提升為6級,全球進入流感大流行階段。2010年8月10日,WHO宣布進入甲流大流行后時期 。根據(jù)WHO公布的數(shù)據(jù),在這段時間甲流疫情波及的國家和地區(qū)達到214個,死亡病例超過18 449人[1]。根據(jù)以往大流行的經(jīng)驗,WHO預(yù)計甲流病毒還會以季節(jié)性流感病毒的表現(xiàn)方式出現(xiàn),并在今后若干年內(nèi)繼續(xù)傳播,病毒很有可能繼續(xù)使年輕人群發(fā)生嚴(yán)重疾病。各國須繼續(xù)對此保持警惕。因此,很有必要依據(jù)疾病監(jiān)測報告或血清學(xué)監(jiān)測估計和預(yù)測甲流在世界各地的流行強度。雖然甲流在全球廣泛流行,但由于大量輕癥患者和隱性感染的存在,疾病監(jiān)測系統(tǒng)報告的確診病例不能反映疫情實際情況,而血清流行病學(xué)調(diào)查方法更適合于調(diào)查不同時間節(jié)點、不同地區(qū)、不同年齡段人群的感染水平及動態(tài)變化趨勢。根據(jù)文獻報道,對于確定甲流的感染率,血清學(xué)監(jiān)測的敏感度是臨床病例監(jiān)測的10倍以上[2]。目前甲流血清學(xué)研究以血凝抑制試驗(HI)、微量中和試驗(NT)為主,兩者都可以用來估計甲流流行后人群的感染率,但均有優(yōu)劣點,以下對其研究進展作一略述。

1 血凝抑制試驗方法(HI)

流感病毒能夠與豚鼠、雞紅細胞或人O型紅細胞發(fā)生凝集,即為紅細胞凝集現(xiàn)象。這種紅細胞凝集現(xiàn)象可被特異性免疫血清所抑制,即紅細胞凝集抑制現(xiàn)象。其原理是相應(yīng)的抗體與病毒結(jié)合后,阻抑了病毒表面的血凝素與紅細胞表面受體的結(jié)合。血凝抑制試驗(HI)是目前最常用的鑒定流感病毒及流感病毒型別的方法。HI長期以來被用作流感病毒感染,疫苗評價,疫苗株篩選的血清學(xué)檢驗方法。該方法簡單、易行、結(jié)果可靠。

1.1 紅細胞種類對HI敏感性的影響 HI的敏感性受到所使用的紅細胞種類的影響。Stephsen指出在檢測H5N1高致病性禽流感HI抗體時馬紅細胞比火雞紅細胞更敏感[3]。在Lerdsmran的研究中,為了確定以鵝紅細胞和火雞紅細胞為凝集細胞的HI試驗是否得到可比的HI抗體滴度,6名科學(xué)家以HI抗體幾何平均滴度為1∶183的人血清為參照,以鵝紅細胞和火雞紅細胞進行平行實驗。結(jié)果表明無論是鵝紅細胞或火雞紅細胞,6人得出的HI抗體滴度都為1∶160[4]。進一步對53名甲流患者的急性期和恢復(fù)期的雙份血清及100名健康醫(yī)務(wù)人員的單份血清進行平行實驗,結(jié)果表明以鵝紅細胞和以火雞紅細胞的HI試驗,兩者HI抗體滴度的相關(guān)系數(shù)達0.96(Spearman's rank,P＜0.01)。HI抗體滴度≥1∶40的人數(shù)、恢復(fù)期與急性期抗體滴度比、抗體滴度呈4倍以上增長的人數(shù)都相似,而且結(jié)果還顯示鵝紅細胞的血凝樣式比火雞的更清晰?；邬Z紅細胞和火雞紅細胞的HI抗體滴度有可比性,而且在東亞和東南亞地區(qū)鵝比火雞更易獲得,所以開展HI試驗時,可用鵝紅細胞代替火雞紅細胞。

1.2 HI抗體陽性臨界值 許多研究者以HI抗體≥1∶40作為判斷甲流感染的臨界值(cut-off value),并以此估計人群的感染率[2,5]。這個臨界值的設(shè)定是根據(jù)WHO指南,即當(dāng)流感HI抗體≥1∶40時,人群中50%的人具有保護性抗體水平[6]。然而,Lerdsmran指出,7.5%的甲流患者恢復(fù)期血清HI抗體＜1∶40[4]。與此類似,Chen報道在甲流患者發(fā)病后的第25至29 d之間,7%的患者其HI抗體＜1∶40[5]。Miller等指出,在55名甲流確診患者中有6名(10.9%)HI抗體滴度低于1∶32[2]。這些結(jié)果提示若以HI抗體滴度≥1∶40衡量甲流的感染情況,可能會低估實際的感染水平。進一步分析顯示,成人和低齡兒童HI抗體產(chǎn)生水平并不一致,應(yīng)以不同的HI抗體陽性臨界值來判斷是否感染甲流。故在 Lerdsmran的研究中,以HI抗體≥1∶20作為低齡兒童的陽性臨界值,而以HI抗體≥1∶40作為成人的陽性臨界值[4]。

1.3 HI抗體與交叉反應(yīng) 甲流流行前人群是否具有一定的交叉反應(yīng)抗體,以及季節(jié)性流感疫苗對甲流病毒是否有交叉保護作用是倍受爭議的問題。在Lerdsmran的研究中,對71名已接種了季節(jié)性流感疫苗對象的血清進行甲流病毒HI試驗,發(fā)現(xiàn)有8名(11.3%)HI抗體滴度在 1∶10至≥1∶40之間,其中有1(1.4%)名 HI抗體滴度為1∶80[4]。同樣,Hancock指出在2007-2009年期間注射三價滅活季節(jié)性流感疫苗的成人中,有7%的人其甲流HI抗體呈現(xiàn)4倍或以上增長。然而,Kelly則指出,季節(jié)性流感疫苗對甲流無保護作用[7],但亦有其他研究者報道季節(jié)性流感疫苗對甲流有部分保護作用[8]。

有學(xué)者報道,由于既往的季節(jié)性流感暴露或疫苗接種,老年人甲流抗體呈較高水平,美國疾控中心也發(fā)現(xiàn)甲流流行前≥60歲年齡組HI抗體陽性率在各年齡組中水平最高[9]。Hancock在報告中指出,在1980年后出生的107名對象中有4人(3.7%)其甲流HI抗體≥1∶40,而1950年前出生的115人中有39人(34%)甲流HI抗體≥1∶80。我國江蘇省曾檢測在2008年11月甲流流行前采集的632份血清,發(fā)現(xiàn)有3.64%能檢出甲流HI保護性抗體(≥1∶40)[10]。而我們先前的報告指出,在2008年人群甲流HI抗體≥1∶10和≥1∶40的陽性率分別為6.5%和0.63%[11]。這些結(jié)果顯示,自然人群在甲流流行前存在著一定的交叉反應(yīng)抗體,可能與感染豬流感病毒或其它具有抗原交叉性的H1N1亞型流感病毒有關(guān)。但迄今為止,國內(nèi)監(jiān)測尚未發(fā)現(xiàn)類似國外報道的高年齡組人群在甲流流行前具有較高HI抗體陽性率現(xiàn)象,這可能與甲流流行前我國流感疫苗接種率顯著低于國外有關(guān)。

1.4 HI抗體的消長 甲流患者或甲流疫苗接種者的HI抗體消長的相關(guān)研究還不多,但Wang在其近期的報告中指出,甲流患者在發(fā)病后的第15 d,HI抗體≥1∶40的比例從發(fā)病前的0%上升到60%,第30 d達到 100%,但在第 180 d下降為52%;而接種單價裂解甲流疫苗的人群HI抗體≥1∶40的比例則為：在接種后的第15 d從接種前的0%上升為78%,第30 d達到81%,第180 d則降為34%[12]。甲流患者在發(fā)病后的第15 d和第30 d,其HI抗體的幾何平均滴度(GMT)無顯著變化,但在第180 d GMT則從第30 d的1∶80下降為1∶52。然而,接種疫苗的對象,其GMT在第15 d為1∶100,在第30 d上升為1∶193,但在第180 d則下降為1∶74。這些結(jié)果顯示,與甲流患者相比,疫苗接種者的HI抗體陽轉(zhuǎn)率低,但GMT卻顯著高而且持續(xù)時間相對較長。無論是經(jīng)自然感染還是通過接種疫苗獲得保護性抗體,在6個月之后約一半的調(diào)查對象喪失了抵抗甲流再次感染的免疫力。

1.5 HI抗體調(diào)查的影響因素 以血清學(xué)方法估計人群的甲流感染率受到幾個混雜因子的影響,如由于接種季節(jié)性流感疫苗引起的交叉反應(yīng),或由于人體內(nèi)存在1957年流感病毒的抗體等。此外,年齡是甲流HI抗體陽性率的獨立相關(guān)因素。我們先前的報告也指出,在甲流流行后的各年齡組之間,無論是HI抗體≥1∶40的率還是 GMT值,均以6～17歲為最高,18～55歲次之,再次為≥56歲,而0～5歲為最低,而且各年齡組之間的差異都有統(tǒng)計學(xué)意義,表明年齡是影響甲流HI抗體水平的因素之一[11]。這與甲流病例的分布主要以年輕人群為主相吻合。但不同性別之間抗體陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義,表明不同性別人群甲流的易感性和感染風(fēng)險類似[10,13]。

2 中和抗體試驗

病毒中和抗體試驗(NT)是敏感而特異的血清學(xué)方法,可直接評價血清對病毒的中和保護能力,是檢測抗體與病毒作用的經(jīng)典方法。其基本原理為血清中的特異抗體與病毒的表面抗原相結(jié)合,使病毒失去感染宿主細胞的能力,從而抑制細胞病變的產(chǎn)生。由于中和抗體在血清中維持時間長,不能僅憑中和試驗為陽性結(jié)果,作為判斷是否有相應(yīng)病毒感染的依據(jù)。

2.1 血清前處理對NT試驗的影響 在開展甲流的血清流行病學(xué)研究時,許多實驗室以NT試驗作為HI試驗的附加試驗。在HI試驗中,通常以霍亂菌液(RDE)對血清進行前處理以去除血清的非特異抑制因子,但在常規(guī)NT試驗中,一般未對血清以RDE進行前處理[2]。Lerdsmran的結(jié)果顯示,對于無甲流HI抗體的血清,如未采取RDE處理,其NT抗體的GMT異常高,但在以RDE處理后,NT抗體的GM T與HI抗體的GM T具有可比性[4]。提示血清中的非特異抑制因子不僅能使HI試驗產(chǎn)生假陽性結(jié)果,也能使NT試驗出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此,建議在以NT試驗檢測甲流抗體時,增加 RDE前處理步驟。

2.2 NT抗體與HI抗體的可比性 Lerdsmran對甲流患者發(fā)病后54 d內(nèi),每隔5 d檢測一次血清HI抗體和 NT抗體,兩種抗體的相關(guān)系數(shù)為 0.85(Spearman's rank,P＜0.0001)。HI抗體和NT抗體都呈4倍增長最早出現(xiàn)在甲流發(fā)病后的第11d。在低年齡組患者中,HI≥1∶20為 100%,≥1∶40為86.1%,而NT 抗體≥1∶20為97.2%,≥1∶40為94.4%。在 44名成人患者中有 43名(97.7%)恢復(fù)期血清 HI≥1∶40,而 100%患者的NT抗體均≥1∶80。Grund等采集43名健康對象在接種甲流疫苗前與接種后第21 d的雙份血清,以NT試驗與HI試驗檢測其抗體水平。結(jié)果顯示,第二份血清NT抗體和HI抗體呈4倍增長的比例均為95.3%,而且兩種抗體的GMT及其增長幅度都呈很好的可比性[13]。這些結(jié)果表明,NT試驗在評價甲流感染后或疫苗接種后抗體的水平變化與HI試驗有良好的可比性。

2.3 NT抗體與交叉反應(yīng) Hancock指出,在接種季節(jié)性流感疫苗的成人中有7%的人其甲流HI抗體呈現(xiàn)4倍或以上增長,而甲流NT抗體陽性率(≥1∶40)則高達22%[9]。Lerdsmran[4]也指出,在已接種了季節(jié)性流感疫苗的對象中,有11.3%的人其HI抗體在1∶10至≥1∶40之間,有1.4%的人高于1∶80,而NT抗體≥1∶40的比例則高達22.5%。Mark等在香港開展的血清學(xué)調(diào)查中發(fā)現(xiàn),在≥65歲以上年齡組人群中,有37%的人在甲流大流行前其NT抗體≥1∶40[14]。說明與HI抗體相比,甲流NT抗體與季節(jié)性流感的交叉反應(yīng)更廣。

由于HI抗體僅與流感病毒的血凝素受體結(jié)合,而NT抗體可與更廣范圍的病毒受體結(jié)合,所以相對于 HI抗體而言,NT抗體反應(yīng)更廣、更敏感[15-16],正由于這個特點,甲流NT抗體與季節(jié)性流感病毒或疫苗的交叉反應(yīng)顯得更高,特別是在50歲以上的接種疫苗者中,其血清NT抗體顯示出高度交叉反應(yīng)[4,9,13]。此外,NT抗體在血清中維持時間長,因此,若以NT抗體≥1∶40作為判斷甲流感染的臨界值,并以此估計人群的感染率,可能會導(dǎo)致感染率的高估。所以,甲流NT抗體陽性臨界值的設(shè)定,還須進一步研究,以準(zhǔn)確評估甲流的感染率。

3 展 望

目前甲流病毒以季節(jié)性流感病毒的表現(xiàn)方式出現(xiàn),在某些地區(qū)形成一定規(guī)模的流行,依然威脅人們的健康。血清流行病學(xué)研究可以準(zhǔn)確監(jiān)測和預(yù)測甲流在不同時間節(jié)點、不同地區(qū)、不同年齡組人群的感染水平及動態(tài)變化趨勢。除了HI和 NT試驗以外,酶免疫實驗法(EIA)和以ELISA為基礎(chǔ)的微量NT試驗也逐步得以應(yīng)用,這些方法更便捷快速,但其敏感度和特異度仍有待進一步探討。

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