細胞膜穿透肽在腫瘤治療中的應用策略

徐雅君 曾慶友,2* 許瑞安*

（1 教育部分子藥物工程研究中心、華僑大學分子藥物學研究所，福建 泉州 362021；2 華僑大學化工學院，福建 泉州 362021）

細胞膜穿透肽（cell penetrating peptide，CPPs）是一些具有細胞穿透功能的短肽的統稱，一般少于30個氨基酸，其中堿性氨基酸占多數[1]。此外，CPPs還能幫助生物大分子穿過血腦屏障且無毒副作用[2,3]。CPP的這些特性使其成為一種有效的運輸載體，向細胞內運送各種自身不能穿越細胞膜的大分子生物活性物質，為生物治療提供了一個嶄新的有力工具。到目前為止，已有CPPs作為載體成功的將多肽、蛋白質、DNA及siRNA等導入細胞內的報道[4-7]。但是隨著研究的深入，我們發現CPPs作為載體，存在與血液的不相容性，缺少組織特異性，易被內體捕獲從而進入溶酶體被降解等問題[8，9]，從而大大的降低了CPPs的轉染率，限制了其在腫瘤治療中的應用。因此，有效解決上述問題是優化CPPs在腫瘤治療中的作用的關鍵。

1 優化CPP的體內相容性

CPP本身具有生物組織相容性且無毒副作用。但是，在體內給藥時，由于CPP中堿性氨基酸占多數，所以，其在生理pH 7.4條件下帶正電荷，易與血液發生作用，引起血栓，從而對人體造成傷害，甚至引發死亡[10,11]。因此，在用CPP作載體，進行體內給藥時，我們要首先對CPP進行修飾來掩蓋其表面的正電荷。載體表面修飾，最常用的方法是聚乙二醇化，聚乙二醇不僅具有很好的生物相容性，還可以增強載體在體內的穩定性并延長其體內循環時間，從而提高藥效。Morris等[12]將細胞膜穿透肽Pep-3聚乙二醇化，并證實了修飾后的Pep-3在體內的穩定性較未修飾的大大的提高了。Van Dongen等[13]也將細胞膜穿透肽Tat和聚乙二醇化聯合起來使用，來提高酶載納米反應器的轉染率。

CPP本身是沒有組織特異性的，所以在進行體內給藥時，CPP會帶著負載的藥物會進入所有組織，這樣就會使到達靶組織的藥物濃度減少[8,14,15]。此外，抗腫瘤藥物一般上對正常組織會有傷害作用，所以，在治療腫瘤的時候我們要盡量使抗腫瘤藥物具有靶向性，能直達腫瘤組織起作用。理論上來說，解決CPP的腫瘤靶向性的問題并不難，但實際上，解決這個問題是一難點。因為在組織中，CPP和接上的配體的作用是相互抑制的。Anderson等[16]將Fab片段與Tat相連，并證實Fab連接后的Tat確實具有細胞靶向性，但是這個研究同時也指出Fab抑制Tat的穿膜能力，而Tat也抑制Fab尋找靶細胞的能力，二者之間存在矛盾。如何解決CPP與配體之間的矛盾呢？首先，我們要考慮到二者的發揮作用的空間的差異，配體是在組織外作用，以達到尋找靶組織的目的；CPP是在細胞膜上起作用，以達到跨膜的目的。其次，我們要考慮到正常組織與靶組織之間的生理差異，如pH的不同，腫瘤特異的酶。最后，我們就可以根據上述兩方面得到一種可行的策略，對CPP進行修飾改造。Jiang等[17]用陰離子多肽將聚精氨酸多肽掩蓋，從而使聚精氨酸不能發揮作用，進入細胞；直到到了腫瘤組織，由于腫瘤組織特異性酶MMP2的存在，切斷了陰離子多肽與聚精氨酸之間的連接，聚精氨酸暴露發揮作用，從而進入腫瘤細胞。

因此，CPP作為載體應用于體內治療時，應考慮先將CPP掩蓋，直至到達靶組織時，再將其釋放。這樣才能使CPP的作用得到很好的發揮，而且將對機體組織的傷害降到了最低。

2 精確CPP的跨膜過程

CPP最初被認為是以非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的方式進入細胞的[18,19]。但從2003年后，人們逐漸發現了細胞內吞作用在CPP應用試驗中的存在，并且最終確認內吞作用是CPP介導藥物進入細胞的主要方式，而直接穿膜作用也是進入細胞的方式之一[20,21]。因此，CPP介導的跨膜作用包括很多途徑，而途徑的選擇不僅與CPP種類及負載藥物的性質有關，而且與靶細胞的種類有關[22-24]。此外，又由于至今為止CPP的跨膜機制還不明確，所以，對于目前的狀況來說，在細胞實驗前確定某一具體的CPP及其負載物進入細胞的途徑幾乎是不可能的，而這種不確定又在很大程度上增加了時間的耗費和成本。解決這個問題的關鍵就是要明確CPP的跨膜機制。

目前已提出了很多CPP的跨膜機制，主要包括3類。第一種是通過靜電作用直接滲透通過細胞膜。具體過程為未折疊的CPP融合蛋白首先與細胞膜表面通過靜電方式結合，然后直接跨過細胞膜，接著在分子伴侶的幫助下發生重折疊[25,26]。這是針對早期研究發現的認為CPP是非溫度依賴、非能量依賴、非受體依賴的非經典內吞方式的跨膜機制。第二種跨膜機制是通過形成某種跨膜結構發生轉導進入細胞。這類機制包括3種可能的模式[27]：反轉微團模式、地毯模式和打孔模式。第三種跨膜機制是內吞作用介導入膜，這類機制是在發現CPP跨膜過程中涉及內吞作用后提出的[28-30]。

雖然現在CPP的跨膜機制還不明確，但是其穿膜特性是肯定的。此外，人們還開始認識到CPP的一次跨膜并不僅僅涉及一種跨膜機制[31]。有很多機制參與CPP的一次跨膜，重要的是哪種機制為主。因此，目前的重點是明確跨膜機制，然后根據其來改造CPP，使其主要按人們想要的那種機制跨膜。

3 促進CPP 從內體逃逸

雖然CPP的一次跨膜涉及很多機制，但是人們發現至今為止應用的CPP負載藥物跨膜都以內吞作用跨膜為主，而又由于內吞作用跨膜時存在內體捕獲和溶酶體降解的問題，所以，我們就要考慮如何幫助CPP及其負載物從內體逃脫，以防止其進入溶酶體，從而在溶酶體堆積或被降解[32,33]。

促進CPP從內體逃逸的方法主要有5種：①化學物質輔助逃逸，如氯喹、Ca2+等。Wattiaux等[34]用熒光標記Tat，并在細胞培養基中加入氯喹，幾小時后在細胞質和細胞核中發現了熒光，首次證實了氯喹可以促進CPP從內體逃脫進入胞質，進入細胞核。Shiraishi等[35]發現在培養基中加入Ca2+能促進CPP偶聯的PNA從內體釋放。雖然Ca2+能明顯促進CPP從內體逃脫，但其作用機制仍不清楚。②光敏物質輔助逃逸。光敏物質能在可見光的激發下產生活性氧簇，而活性氧簇能破壞內體膜，促進內體內物質釋放進入胞質。因此，應用CPP作為載體運送生物活性物質進入細胞內的同時給予光敏物質可促進內含體內含物的釋放。Endoh等[36]將siRNA連接到CPP上，在激光的照射下，CPP成功將siRNA導入到CHO細胞，誘導U1A基因的沉默。③天然或合成的聚合物輔助逃逸，例如蜂毒肽及人工合成的短肽如43E（LAEL-LAELLAEL）。Ogris等[37]將蜂毒肽結合到聚乙烯亞胺PEI上，形成MELPEI-DNA復合物，發現蜂毒肽能促進DNA從內體釋放到胞質，并引導其跨過核膜屏障進入細胞核。④病毒微生物輔逃逸，例如流感病毒血凝素2蛋白（HA2）。一些病毒微生物在進化過程中獲得了從內體逃逸的本領，而這種逃逸與微生物自身元件在低pH值環境中，破壞內含體溶酶體膜有關[38]。Sugita等[39]用熒光素標記TAT，分別處理細胞，發現TAT單獨處理時熒光只是集中在內體，而與TAT-HA2共處理后則發現細胞質中有大面積熒光。⑤ CPP自身改造促進逃逸[40,41]。雖然上述5種方法能促進CPPs及其負載物從內體逃逸，但卻存在操作繁瑣、運送載體構造復雜及毒副作用較大等缺點。因此，人們開始尋找更簡便、更安全的方法來促進CPP的內體逃逸，對現有CPPs進行改造是最可行的方法。目前已提出很多關于CPP改造的方案，也已對很多方案進行試驗驗證，雖然有所進展，但仍缺少實質性的突破。

5 結語與展望

細胞膜穿透肽可以有效地將多肽、蛋白質及DNA片段等生物大分子導入多種哺乳動物細胞，且在一定濃度范圍內不會造成細胞損傷。目前，雖然CPP在應用過程中存在很多的問題，甚至CPP的跨膜機制也不明確，這是造成很多問題的關鍵。但是仍可以肯定CPP是生物活性分子有效的細胞內轉運工具，而且我們有理由相信，經過改造的CPP，未來的CPP將作為高效的生物藥物輸送載體，在疾病的預防、檢測及治療中發揮重要的作用[42]。

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