羥基紅花黃色素A的提純新工藝研究

(鄭州大學化工與能源學院，河南鄭州 450001)

紅花(Carthamus tinctorius L.)屬于雙子葉植物綱的菊科一年生草本植物［1］。具有活血通經、祛痛止痛的功效［2］，是中醫傳統的活血化瘀藥。紅花化學成分復雜，生物活性廣泛，目前是當今世界研究和應用的“熱點”植物之一。紅花黃色素為紅花抗血栓的有效部位［3］，HSYA是紅花的主要藥效成分［4］，具有抗血小板激活因子的作用［5］，已作為治療心腦血管疾病的新藥被列入國家藥品標準［1］。

大孔吸附樹脂分離技術是20世紀60年代末發展起來的一種新型分離技術［6］。大孔吸附樹脂是一類新型有機高分子聚合劑，具有穩定性高、選擇性好、不受無機物的影響、再生簡便、解吸條件溫和、使用周期長、易于連續操作、成本低等諸多優點。目前，大孔吸附樹脂已廣泛應用于環保、化工、醫藥和食品等領域。張亮等［7］研究了大孔吸附樹脂對紅花提取液的純化，制得的HSYA純度為35.7%。

中草藥原料中許多有效成分受熱易發生氧化、水解、聚合結構變形等化學結構的變化，從而影響藥效。膜分離技術是一種新型、高效的分離技術，以壓力差或電位差為推動力，利用篩分原理達到對不同分子量組分的分離、濃縮和提純［8］。將膜分離技術用于紅花提取液的分離純化過程，其相對溫和的操作條件更利于保持產品的性能穩定［9］并且節能。

目前報道的關于純化HSYA的方法很多，但是HSYA的純度不夠高，難以達到注射劑用藥的要求，本文在前期研究的基礎上，旨在探討新的工藝路線，為制備高純度、高附加值的HSYA產品奠定基礎。

1 實驗部分

1.1 材料和裝置

紅花，購于河南農科院，產地新鄉;羥基紅花黃色素A對照品，HPLC 99%，四川省維克奇生物科技有限公司;甲醇，色譜純99.9%;磷酸，分析純85%;無水乙醇，分析純99.7%;乙醇，醫用酒精95%;PES10超濾膜，上海亞東核級樹脂有限公司;大孔吸附樹脂，滄州寶恩化工;FILMTEC納濾膜。

電子分析天平，BS224S，北京賽多麗儀器系統有限公司;紫外/可見分光光度計，UV－2450，日本島津公司;高效液相色譜儀，Agilent 1100，美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

通過靜態吸附、脫附實驗選取適宜的大孔吸附樹脂;通過膜性能的測定選取適宜的納濾膜。在前期研究的基礎上，制備HSYA提取液，經過微濾除去固體顆粒物質，微濾透過液作為本研究的原料液。精制原料液的工藝流程如圖1所示。

圖1 HSYA精制工藝流程圖

通過超濾過程除去大分子物質，通過大孔吸附樹脂吸附、洗脫劑洗脫，收集醇洗脫液，最后經納濾濃縮得濃縮液(浸膏狀)。水溶解浸膏物，采用HPLC檢測溶液中HSYA的純度。

1.3 分析方法

1.3.1 HSYA 的提取率

HSYA提取率的計算公式為:

式中:c為n次提取液混合后溶液中HSYA的濃度，g/L;V為n次提取液混合后溶液的總體積，mL;m0為所用紅花的質量，mg。

1.3.2 HSYA的標準曲線的制定

利用紫外可見分光光度計，在波長401 nm處，測定不同濃度HSYA的吸光度，繪制HSYA對照品的吸光度—濃度的標準曲線。精確稱取HSYA對照品13.8 mg，蒸餾水定容于50 mL容量瓶中，得到濃度為 0.276 g/L 的 HSYA 溶液。精確移取0.7、0.8、1.0、1.1、1.3、1.5、1.7、1.9 mL 于 25 mL 容量瓶中，蒸餾水定容。以各溶液在401 nm處的吸光度值A為縱坐標，溶液的濃度c為橫坐標做圖，得標準曲線為 A=0.03851c+0.00688(r=0.99994)，線性范圍:7.728 ～20.976 mg/L。其中，c的單位為 g/L。

1.3.3 HPLC 色譜條件

色譜柱:ZORBAX SB－C18 5 μm 4.6 × 250 mm;流動相甲醇:0.5%磷酸水溶液(體積比40∶60);流速:0.8 mL/min;柱溫:20℃;檢測波長:401 nm。以保留時間定性，峰面積定量，外標法計算。

1.3.4 大孔吸附樹脂吸附量、解吸率的測定

吸附量Q的計算公式如下:

式中:Q為吸附量，mg HSYA/g樹脂;c0為吸附前溶液的濃度，g/L;ct為吸附后溶液的濃度，g/L;V為溶液體積，mL;W為樹脂質量，g。

解吸率的計算公式如下:

式中:c為濾液中HSYA的濃度，g/L;V為濾液體積，mL;Q為樹脂的吸附量，mg HSYA/g樹脂;W1為吸附飽和的樹脂質量，g。

1.3.5 膜分離性能的測定

截留率R的計算公式如下:

式中:c1和c2分別為原料液和透過液中HSYA的濃度，g/L。

滲透通量的計算公式如下:

式中:V為透過液體積，L;S為膜的有效面積，m2;t為取樣時間，h;J為滲透通量，L/(m2·h)。

2 實驗結果與討論

2.1 HSYA 的提取

通過正交實驗確定了最優的提取HSYA的工藝條件為:水提取，提取溫度45℃，提取時間45 min，料液比為1∶20，提取2次。在最佳條件下提取HSYA的平均提取率為7.516 5%。提取時各因素對提取率的影響大小依次是:提取時間＞提取次數＞提取溫度＞料液比。

2.2 大孔吸附樹脂的選取

除了大孔吸附樹脂的分子結構外，宏觀結構對其吸附量、吸附速度以及吸附選擇性等性能也有一定的影響。樹脂的宏觀結構主要包括顆粒的形狀、粒徑、粒徑分布、孔隙率、孔的形狀、孔的大小、孔徑分布以及比表面積等。9種大孔吸附樹脂的物理參數如表1所示。

表1 選用樹脂的物理參數

吸附量是衡量大孔吸附樹脂分離天然產物的重要技術參數之一，不同樹脂對不同成分的吸附量不同，這是基于樹脂對物質具有選擇吸附的能力。本實驗選擇了9種大孔樹脂對HSYA的吸附量和解吸率進行了探討，結果如圖2、圖3所示。

由圖2可知，對HSYA吸附量較好的樹脂有HPD200A、HPD300、HPD100、HPD700 和 HPD722。大孔吸附樹脂的比表面積影響樹脂的吸附量，比表面積越大，吸附量也越大，同時樹脂的孔徑也影響吸附量，孔徑太大或者太小吸附量都會降低，HPD200A的比表面積和孔徑比較適中，吸附量最大;HPD100A的比表面積小，孔徑大，導致吸附量最小。

圖2 9種樹脂對HYSA的吸附量

圖3 9種樹脂的解吸率

由圖3可知，樹脂 HPD100的解吸率最高，HPD700的解吸率最低，但樹脂的解吸率都普通較高。樹脂的吸附強度和洗脫劑的強度影響樹脂的解吸率，在同一洗脫劑下，主要是樹脂的吸附強度影響解吸率，只要樹脂對目標成分的吸附沒有達到死吸附，解吸率都不會太低。

2.3 納濾膜的選取

植物有效成分提取分離常用的蒸發分離主要基于不同組分揮發性的差異，很可能對熱敏性物質造成不可逆轉的損害，并且耗能。而膜分離主要基于分子的大小(分子半徑與其相對分子質量相關)，納濾膜的截留相對分子質量介于超濾膜和反滲透膜之間，對相對分子質量在200～1 000之間的低分子有機物以及多價鹽有較好的截留效果。除了考慮對HSYA的截留外，同時還應考慮膜的滲透通量，這是選擇用膜的兩個關鍵參數。實驗用膜的性能參數見表2。

表2 膜性能參數表

3種納濾膜的分離性能結果如表3所示。采用切割相對分子質量為1 000的NF270－400膜作為分離膜，其滲透通量最大，但對HSYA的截留率相對而言偏低;切割相對分子質量為300的NF90－400膜的截留率最高，但滲透通量最小;切割相對分子質量為600的NF200－400膜的截留率與NF90－400膜的截留率相當，但其滲透通量要大于NF90－400膜的滲透通量。由此可知，納濾膜的切割相對分子質量越小，其對HSYA的截留率越高，同時其滲透通量也越小。

表3 3種類型的膜對分離性能的影響

2.4 納濾膜的截留率R的變化

實驗過程中3條工藝路線中NF200－400納濾的截留率如表4所示。

表4 3條工藝路線中納濾膜NF200－400的截留率

由表4可知，濃度影響膜的截留率，濃度越小，截留率也越大;乙醇的存在影響膜的截留率，可以使膜的截留率增大，由于HSYA易溶于水，不容易無水乙醇，乙醇的存在可以使部分HSYA沉淀，乙醇的濃度越大，截留率也隨之增大。

2.5 HSYA提純工藝路線的評價

超濾過程是利用一種壓力活性膜，在外界推動力(壓力)作用下截留料液中的膠體、顆粒和相對分子質量相對較高的物質，而相對分子質量小的物質透過膜的分離過程。通過超濾過程，可除去大部分的膠體，大分子的物質以及大量的有機物。由于HSYA易溶于水，不溶于無水乙醇，溶解度隨著乙醇濃度的增加而減小，乙醇的存在使HSYA部分沉淀。因此，先經超濾過程除去大分子物質，再經過大孔吸附樹脂的吸附、洗脫過程富集HSYA，最后經過納濾濃縮得到較高純度的HSYA產品。通過高效液相色譜法檢測產品中HSYA的純度，溶液Ⅰ中HSYA占58.250%，溶液Ⅱ中 HSYA 占50.700%，溶液Ⅲ中HSYA占54.072%。通過超濾過程除去溶液中的大分子物質，由工藝路線一制得的產品純度較高，即58.250%。

3 結論

通過不同工藝流程的試驗，發現采用PES10超濾膜、大孔吸附樹脂HPD200A與NF200－400納濾膜相結合的方法純化HSYA，產品純度最高可達到58.25%。

［1］中華人民共和國衛生部藥典委員會.中國藥典［M］.北京:人民衛生出版社，2005.

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