農田雜草抗藥性檢測方法研究進展

董立堯, 呂 波, 徐江艷, 李 俊

(1.南京農業大學植物保護學院/農業部作物病蟲害監測與防控重點開放實驗室，江蘇南京 210095； 2.南京農業大學理學院/江蘇省農藥學重點實驗室，江蘇南京 210095)

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農田雜草抗藥性檢測方法研究進展

董立堯1，2, 呂 波2, 徐江艷1, 李 俊1，2

(1.南京農業大學植物保護學院/農業部作物病蟲害監測與防控重點開放實驗室，江蘇南京 210095； 2.南京農業大學理學院/江蘇省農藥學重點實驗室，江蘇南京 210095)

雜草抗藥性問題備受全球關注。文章通過檢索國內外已報道的有關雜草抗藥性的文獻，對實驗室常用的雜草抗藥性檢測方法進行了概述，并將雜草抗藥性檢測方法歸納為整株水平、器官或組織水平、細胞或細胞器水平以及分子水平，并對這些方法進行了簡要分析，可為研究人員或農技推廣人員根據快速、準確、經濟等不同需要提供相應的雜草抗藥性檢測方法。

雜草； 抗藥性； 檢測

1942年2,4-滴的發現揭開了近代化學除草的新紀元。由于除草劑連續使用，很快導致了雜草抗藥性的產生[1]。1950年在美國夏威夷的甘蔗田發現了多年生雜草竹節花(又稱鋪散鴨跖草，Commelinadiffusa)對2,4-滴產生了抗藥性。從20世紀80年代開始，世界范圍內大量應用除草劑，全球抗藥性雜草的發展幾乎呈直線上升。根據Heap統計，截至2010年10月，全球已有194種(114種雙子葉，80種單子葉)雜草的348個生物型在各類農田系統對19類化學除草劑產生了抗藥性[2]。抗藥性雜草已成為雜草治理和農業生產的嚴重威脅，由其引發的嚴重經濟和農業安全問題倍受全球關注。

隨著雜草抗藥性研究的不斷深入，雜草抗藥性檢測方法也不斷創新。1970年美國學者Ryan首次公開報道了歐洲千里光(SeneciovulgarisL.)對三氮苯類除草劑西瑪津和莠去津產生了抗性，提出了整株植物測定方法，標志著雜草抗藥性生物測定方法的誕生。隨著科學研究的深入和科學技術的創新，雜草抗藥性檢測方法不斷發展，出現了種子培養皿測定法、葉片葉綠素熒光測定法、DNA分析法等不同水平的檢測方法。為了便于研究人員或農技推廣人員在具體操作過程中根據快速、準確、經濟等不同的需要選擇適宜的檢測方法，本文通過檢索文獻，歸納分析了目前比較常用的雜草抗藥性檢測方法。

1 常用雜草抗藥性檢測方法

1.1 整株水平測定方法

1.1.1 整株植物測定法 一般所使用的方法為Ryan法(1970)?；静僮鳎菏紫葟拈L期單一使用某除草劑并懷疑有抗藥性的田塊及未使用過該除草劑的田塊采集雜草種子，按小區大田播種或溫室盆栽，在播后芽前或苗后進行常規施藥處理。藥劑設置不同劑量或濃度梯度，計算不同劑量下雜草的出苗率、死亡率、鮮重抑制率等指標，與對照比較，以確定抗藥性水平[3]。2007年楊彩宏等利用整株植物測定法研究了江蘇、安徽11個點油菜田日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈的抗藥性，并用同樣的方法進行了相關藥劑交互抗性的測定，發現句容點的日本看麥娘對此藥劑已產生明顯抗性，并對芳氧基苯氧基丙酸酯類其他藥劑產生了不同程度的交互抗性[4]。

1.1.2 幼苗檢測法 該法基本操作：將懷疑對某種除草劑有抗藥性及敏感的雜草種子分別放在盛有水的培養皿中培養，待根長至3～5 mm時，把帶根種子轉移到封閉瓶中的濾紙上，將不同濃度藥劑溶液加到瓶中，在一定條件下培養，通過測量芽長或胚芽鞘長度測定雜草抗藥性水平[5]。2002年Retrum等采用幼苗檢測法研究了大狗尾草對烯禾啶的抗藥性，發現該法可以有效地區分抗性和敏感種群[6]。

1.2 器官或組織水平測定方法

1.2.1 培養皿種子檢測法 這種方法是把催芽的雜草種子放在加入藥劑的瓊脂平面或浸藥的濾紙上培養，通過測定發芽數、主根長、鮮重等指標診斷抗藥性水平。2007年楊彩宏等在油菜田日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈抗藥性研究中也使用了培養皿種子檢測方法，結果與整株植物測定法趨勢一致，結果相符[4]。2008年丁君等采用培養皿種子檢測法測定了再生煙草種子對苯磺隆的抗性，以及對煙嘧磺隆、噻吩磺隆、嘧硫草醚和莠去津的交互抗性，發現經苯磺隆抗性選育的再生煙草抗性顯著提高，并且對這4種除草劑存在不同程度的交互抗性[7]。

1.2.2 分蘗檢測法 該方法通常先將雜草種子種植在粗沙和泥炭(體積比為1 ∶3)的混合物中，在溫室內培養至3葉期(第3葉未充分展開)時，選取正生長的分蘗，去根，然后放在一定的高濃度藥劑溶液中，一段時間后，通過比較第3葉壞死程度來評價雜草的抗藥性水平[8]。2000年Kim等在研究稗草對敵稗和精口惡唑禾草靈的抗藥性時發現，根據分蘗的壞死程度可以快速檢測抗性和敏感雜草生物型[9]。

1.2.3 花粉粒萌發法 按分蘗檢測法種植雜草，剪取剛從穎片抽出的具花藥的穗，把花粉震落到0.25%含一系列濃度除草劑的固體瓊脂培養基上。在一定條件下培養一段時間后，用顯微鏡(200倍)觀察花粉萌發情況。萌發花粉計數以花粉管長度至少達半個花粉粒長度為準。在時間和劑量的最適選擇下，根據萌發花粉數的多少來判定抗性和敏感性生物型[10-12]。2007年Burke等用花粉粒萌發法研究了假高粱對ACC酶抑制劑類除草劑的抗藥性，發現用烯草酮處理6 d后，抗性和敏感生物型在500 nm處的吸光度存在差異[13]。

1.2.4 葉圓片浸漬技術測定法 首先將葉圓片浸漬在含有一定濃度除草劑的磷酸緩沖溶液的試管中，抽真空，待葉圓塊下沉至試管底部后，解除真空，加入少量碳酸氫鈉溶液，照光。對除草劑不敏感或產生抗藥性的生物型，光合作用未被抑制，組織間產生足夠多的O2，葉圓片上??；而對除草劑敏感的生物型，光合作用受抑制，不能產生足夠多的O2，圓片仍沉在試管底部。根據一定時間內上浮的葉圓片數或上浮需要的時間來比較光合作用的強弱程度，以此來確定對除草劑敏感或抗性生物型[12,14]。

1.3 細胞或細胞器水平測定方法

1.3.1 葉片葉綠素熒光測定法 葉綠素熒光測定法機理是：在黑暗的條件下用閃光燈照射光合作用抑制劑類除草劑處理過的葉片時，光合作用抑制劑阻斷電子由QA到QB的傳遞，光系統Ⅱ的還原端被中斷，捕獲的光能不能往下傳遞，葉綠素a處于激發態，以熒光的方式釋放能量，通過測定葉綠素a發射熒光的強弱檢測抗藥性，抗性植株葉片表面的熒光強度小，敏感性生物型葉片表面的熒光強度大，所以，根據葉片表面的熒光強度，可區分抗藥性生物型和敏感生物型[8]。1992年Lehoczki等用相同濃度的百草枯處理抗性和敏感性小蓬草生物型后，二者均快速表現出典型的百草枯藥害癥狀，CO2固定和葉綠素熒光受到抑制、氧釋放減少、已烷生成受到刺激，不同的是百草枯對敏感生物型的抑制不可逆轉，而抗藥性生物型植株在光照中得到恢復，而且光照強度的增加對葉綠素熒光的恢復作用非常明顯[15]。

1.3.2 離體葉綠體測定方法 離體葉綠體測定法的研究證實了雜草抗藥性是由于改變了類囊體膜上的光系統Ⅱ成分，從而改變了光系統Ⅱ還原端的電子傳遞反應。葉綠體的提取采用的是酶解法，離體葉綠體光還原反應的測定包括希爾反應和熒光反應。希爾反應是將葉綠體提取，放入希爾反應介質中，有氧化劑存在(DCPIC)時，在光照下會放出氧氣，同時將氧化劑還原。熒光反應是通過測定葉片中熒光強度來鑒定光系統Ⅱ的功能。葉綠體熒光測定須在黑暗中進行，藍色閃光照射葉綠體懸浮液，葉綠素發射熒光，用光電極管測定發射的熒光，并記錄在X-Y記錄儀上[3,8]。此外，還可以通過測定葉綠素含量的變化檢測抗藥性。1990年Joseph等的研究表明，野燕麥對苯氧羧酸類除草劑禾草靈的抗藥性生物型和敏感性生物型葉片內葉綠素a和葉綠素b的含量表現不同[16]。

1.3.3 光合速率測定法 由于抗光合作用抑制劑生物型雜草在光合作用抑制劑處理后其光合速率變化不大，而敏感生物型則受到嚴重抑制，因此，通過測定光合速率的變化研究光合作用抑制劑對植物或葉片的影響，可以檢測鑒定雜草抗藥性。主要方法有紅外線CO2測定法、氧電極測定法、pH比色法、氣流測定法、改進的干重測定法和半葉法等[8]。1992年Preston等用百草枯處理敏感型大麥草，其體內光合作用氧氣釋放被抑制了66%，而處理抗性大麥草生物型后，除草劑對光合作用氧氣釋放的抑制作用不明顯[17]。

1.3.4 呼吸速率測定法 測定方法可參照光合速率測定法[8]。

1.3.5 吸收和輸導測定法 任何一種除草劑要發揮其除草活性，必須條件是這種除草劑能被雜草吸收并將足以發揮作用的劑量運輸到作用部位。因此，除草劑在敏感雜草和抗性雜草體內的吸收和輸導差異可用于檢測雜草抗藥性。Baerson等[18]和Lorraine-Colwill等[19]通過比較抗草甘膦的瑞士黑麥草和敏感的瑞士黑麥草生物型對草甘膦的吸收和輸導，發現草甘膦在二者體內的輸導差異明顯，敏感型體內的草甘膦匯聚在植物的根，而抗性生物型體內的草甘膦則匯聚在葉尖，他們認為草甘膦在植物體內隨蒸騰流快速向上移動后被泵入木質部，不能泵到韌皮部匯聚到生長點,即輸導方向的改變是產生抗藥性的原因。

1.3.6 酶活與代謝檢測法 對于一些靶標已明確的除草劑，可通過測定靶標酶或與靶標酶催化的反應存在密切關聯的酶的活性差異或某些代謝物質量的差異判斷雜草抗藥性。例如，乙酰乳酸合成酶(ALS)和乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑類除草劑在生產上應用廣泛，作用位點均是細胞內的重要生化反應關鍵酶，通過作用于這些酶從而抑制細胞分裂，使組織失綠、黃化，植株逐漸死亡。因此，通過比較感抗生物型的ALS和ACCase相對活性的高低，便可以鑒定出抗藥性生物型[20-21]。2004年de Prado等發現抗性綠色狗尾草體內的ACCaseⅠ對禾草靈的敏感程度比在敏感狗尾草中降低了30.8倍[22]。

此外，在若干雜草中，促進除草劑代謝解毒也是導致產生抗性的原因，此種代謝作用主要是促進細胞色素P450單加氧酶、葡糖基轉移酶(GT)與谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)活性而產生[23]。2010年韓瑞娟等在日本看麥娘對高效氟吡甲禾靈代謝抗性的初步研究中，發現了抗性生物型體內細胞色素P450還原酶和谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)的活性高于敏感日本看麥娘[24]。

1.4 分子水平檢測方法

分子生物學方法包括酶聯免疫方法、DNA分析法、RNA分析法等，在雜草抗藥性研究中已得到廣泛和成功的應用。

1.4.1 酶聯免疫法 酶聯免疫法[25](enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)始于20世紀70年代，是把抗原或抗體在不損壞其免疫活性的條件下預先結合到某種固相載體表面。測定時，將受檢樣品和酶標抗原或抗體按一定程序與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原或抗體復合物。反應終止時，固相載體上酶標抗原或抗體被結合，其量與標本中待檢抗體或抗原的量成一定比例。經洗滌去除反應液中其他物質，加入酶反應底物后，底物被固相載體上的酶催化變為有色產物，最后通過定性或定量分析有色產物量即可確定樣品中待測物質含量。2002年Reade等建立了田間酶聯免疫測定看麥娘谷胱甘肽-S-轉移酶(GSTs)豐度檢測看麥娘對綠麥隆、異丙隆和精口惡唑禾草靈抗藥性的技術[26]。

1.4.2 DNA(或RNA) 分析法 對于已經獲知編碼基因的除草劑靶標酶，可使用DNA(或RNA)分析方法判斷雜草的抗藥性。該法通常先提取基因組總DNA(或RNA)，再進行PCR擴增，然后對克隆的PCR產物進行測序，通過序列同源性分析便可檢測雜草的抗藥性。2008年Corbett等利用PCR-RFLP方法成功鑒定了抗性莧屬雜草體內乙酰羥基酸合成酶(AHAS)的4處突變位點[27]。2009年盧宗志等采用PCR技術，分別對抗藥性和敏感性雨久花生物型的ALS基因片段進行擴增和基因克隆，并對獲得的DNA序列片斷進行測序比對，與敏感性雨久花生物型ALS相比，抗藥性雨久花生物型的ALS基因共有3處發生突變[28]。

2 雜草抗藥性檢測方法的分析與討論

雜草抗藥性檢測方法多種多樣，除了上面介紹的方法外，還有傳統的田間觀察法、小球藻法、愈傷組織和懸浮培養法、原生質體培養法等，但由于這些方法在實際應用中存在諸多不足，已很少使用。

從雜草抗藥性檢測快速、準確的要求考慮，可以選擇分子水平測定方法。酶聯免疫方法通過制備雜草產生抗藥性過程中某些關鍵酶變化的單克隆抗體，可以靈敏、專一、微樣、簡單快速檢測雜草的抗藥性，該技術比其他檢測方法表現出更多的優越性，靈敏度高、干擾小、安全性高、污染少，而且操作簡便快捷。但它也存在一些缺陷，如不能同時分析多種成分，對試劑選擇性高，對結構類似的化合物有一定程度的交叉反應，對儀器要求嚴格，耗資大。DNA分析技術具有分析速度快、信息量大、準確度高等優點，但相對其他傳統技術所需成本要高。因此，對于一些靶標已明確的除草劑，酶活與代謝檢測方法能準確地檢測出抗藥性雜草生物型，同時還能進一步研究雜草抗藥性機理的產生原因。

從雜草抗藥性檢測快速、經濟的要求考慮，可以選擇培養皿種子生測法，該法是幼苗生測法的改進，所需的植物培養時間較短，相對快速、廉價，尤其是對大量雜草種群的常規抗藥性檢測非常重要。但培養皿種子生測法要求供試的種子一定要有較高的發芽率和發芽勢，否則會影響測定結果的可靠性。對田間正在生長的雜草，采用花粉粒萌發法可實現快速抗藥性檢測。

從雜草抗藥性檢測客觀、經濟的要求考慮，可采用整株植物測定法，該法操作簡便，所需試驗條件易于滿足，田間和溫室試驗方法均易掌握，可用大批植株同時進行。但重復性較差，植物培養所需時間長。

從除草劑使用方式和作用機理的不同考慮，檢測土壤處理的除草劑，可以采用幼苗檢測法或培養皿種子檢測法。檢測莖葉處理的除草劑，可以采用整株植物測定法、分蘗檢測法。檢測內吸傳導型除草劑，可以采用吸收和輸導測定法。檢測光合作用抑制劑類除草劑，可以采用葉片葉綠素熒光測定法、離體葉綠體測定法、葉圓片浸漬技術測定法或光合速率測定法。檢測呼吸作用抑制劑類除草劑，可以采用呼吸速率測定法。

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Research Advance on Detection Methods for Weed Herbicide-resistance

DONG Li-yao1，2, Lü Bo2, XU Jiang-yan1, LI Jun1，2

( 1. College of Plant Protection,Nanjing Agricultural University/Key Laboratory of Monitoring and Management of Crop Diseases and Pest Insects,Ministry of Agriculture,Nanjing 210095,China；2. College of Science,Nanjing Agricultural University/Jiangsu Key Laboratory of Pesticide Science,Nanjing 210095,China)

The weed herbicide-resistance problem has become a global concern recently. In order to provide a rapid,accurate and economic detection methods for agricultural research and extension workers,documents concerning detection methods of weed herbicide-resistance reported at home and abroad were outlined and analyzed according to its research level on whole plant, organ or tissue,cells or organelles and molecular base respectively.

weed; herbicide-resistance; detection

2011-03-15

國家自然科學基金(編號:30971928)；江蘇省農藥學重點實驗室2010年度項目。

董立堯(1960—)，男，博士，教授，從事除草劑毒理及抗藥性研究。Tel:(025)84395672; E-mail:dly@njau.edu.cn。

S451

A

1003-935X(2011)02-0001-04

董立堯,呂 波,徐江艷，等. 農田雜草抗藥性檢測方法研究進展[J]. 雜草科學，2011，29(2)：1-4,9.