HPLC法測定己酮可可堿葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛限量

李啟彬 李青麗

HPLC法測定己酮可可堿葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛限量

李啟彬 李青麗

目的采用HPLC法測定己酮可可堿葡萄糖注射液中5-羥甲基糠醛限量。方法ODSC18柱(250×4.6mm,5μm),以甲醇 ∶水 ∶三乙胺(50∶50∶0.1)為流動相,檢測波長為 284nm。結果回歸方程 A=4100.91+53467.52C(r=0.999,n=5),在濃度 1μg/ml～20μg/m l的范圍內線性良好,加樣回收率為 99.89%,RSD=0.19%。結論本方法準確而靈敏,能有效地控制 5-羥甲基糠醛的限量。

己酮可可堿葡萄糖注射液;5-羥甲基糠醛;HPLC

己酮可可堿為一種甲基黃嘌呤類血管擴張劑,臨床用于缺血性腦血管疾病、血管性頭痛和血栓閉塞性脈管炎的治療。己酮可可堿葡萄糖注射液為含己酮可可堿和5%葡萄糖的滅菌水溶液。其中葡萄糖降解產物 5-羥甲基糠醛(5-HMF)的控制是重要的質量指標,限度應不低于中國藥典中葡萄糖注射液的限度要求。但按照文獻[1]方法采用分光光度法于 284nm處直接測定 5-HMF時,由于己酮可可堿在此波長有最大吸收,對測定產生干擾。筆者采用高效液相色譜法測定己酮可可堿葡萄糖注射液中 5-HMF的限量,以提高檢測的準確度及靈敏度。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀:SSITP420;檢測器型 號:SSI500DETECTORVariable UV/VIS;己酮可可堿:上海申興藥廠提供(批號:20000105);5-HMF對照品:美國 Sigma公司提供(批號:H 9877);己酮可可堿葡萄糖注射液:南京小營制藥廠提供(批號:00052001、00052002、00052003);甲醇 (色譜純);三乙胺(分析純)。

2 結果

2.1 色譜條件 色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠 250mm×4.6mm;流動相為甲醇:水:三乙胺(50:50:0.1);流速:1.0m l/min;檢測波長:284nm。

2.2 標準儲備溶液的配制 精密稱取 5-HMF對照品 12.5mg,置 25ml容量瓶中,加水溶解并稀釋置至刻度,搖勻,使成 0.5mg/m l的標準儲備液,備用。

2.3 系統適用性試驗 取 5-HMF標準儲備溶液 10μl,注入高效液相色譜儀中,記錄色譜圖,根據保留時間tR和半高峰寬(W 1/2h)計算色譜柱的理論板數。理論塔板數 n=5.54(tR/W 1/2h)2以 5-HMF計算,n=14029。

2.4 標準曲線的制備 精密量取 5-HMF標準溶液 0.2m l、1m l、2ml、3ml、4ml分別置于 100m l容量瓶中,加水分別制成1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml的溶液。按上述色譜條件進行測定,記錄峰面積。以峰面積均值 A對其濃度 C線性回歸,得到回歸方程 A=4100.91+53467.52C,(r=0.9999,n=5)。結果表明,5-HMF在濃度 1μg/ml～20μg/ml的范圍內線性良好。

2.5 檢測限的確定 檢測限是指試樣中被樣檢測物能被測出的最低量。檢測方法為信噪比法,即:將低濃度試樣測出的信號與空白樣品測出的信號進行比較,算出能檢測出的最低濃度或量。一般以信噪比為 3:1或 2:1時相應濃度或注入儀器的量確定檢測限。精密稱取 5-HMF10mg,以流動相稀釋至 50m l,制備成濃度 200μg/ml的高濃度溶液,再分別稀釋制成 20μg/ml和 40μg/ml的溶液。取三種樣品各 10μl注入高效液相色譜儀中,信噪比符合 3:1或 2:1的樣品濃度即為 5-HMF的檢測限。

2.6 精密度試驗 取5-HMF標準儲備液配制成 5μg/ml的溶液,重復進樣 5次,測定5-HMF面積積分值,代入標準曲線計算濃度,并計算出RSD=0.22%。

2.7 穩定性試驗 由于采用本品注射液直接進樣,因此方法學研究中無需考慮本項內容。

2.8 重復性試驗 取同一批樣品,重復測定 5次,RSD=0.76%。

2.9 回收率測定 精密量取已知 5-HMF限量的同一批己酮可可堿葡萄糖注射液 1ml,共 9份,分別精密加入 5-HMF標準儲備液 10μl、20μl、30μl,搖勻。各取上述溶液 10μl,分別注入色譜儀,記錄色譜圖,計算回收率。

2.10 樣品的測定 樣品中 5-HMF的限度確定:根據中國藥典 2005版二部葡萄糖注射液檢查項下對 5-HMF的限度要求,取 5-HMF對照品適量,加水制成在 284nm吸收度為0.32的溶液,照上述測定方法測定,代入標準曲線計算濃度和含量,計算結果 5-HMF含量為 12.5μg/m l。故樣品中 5-HMF的限量應為 12.5μg/ml。樣品中 5-HMF的含量測定:精密量取己酮可可堿葡萄糖注射液樣品10μl注入高效液相色譜儀,按上述色譜條件,記錄色譜圖至主分峰保留時間的2倍,測得 5-HMF的色譜峰面積;另精密量取5-HMF標準儲備液 1.25ml置 50m l容量瓶中,加水稀釋至刻度,藥勻,得濃度為 12.5μg/ml的對照品溶液。精密取 10μl注入高效液相色譜儀中,同法測定峰面積,除空白溶液峰和其他雜質峰外,按峰面積外標法計算。

3 討論

對于以葡萄糖為載體的輸液劑,國內外藥典多采用 284nm測定吸收度的方法控制產品中 5-HMF量,濃度不同,吸收度的限度不同。紫外分光光度法因簡單、通用、無需對照品而作為首選方法。但本品主藥己酮可可堿對檢測有干擾,故采用 HPLC外標法,按照中國藥典中葡萄糖注射液限度要求,用對照品進行限度等量轉換試驗,以確定合適的 5-HMF限量。筆者認為,HPLC法測定己酮可可堿葡萄糖注射 5-HMF的限量準確性高、靈敏度及重現性好,是控制己酮可可堿葡萄糖注射液中 5-HMF限量的行之有效的方法。

[1] 國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典(II)部.北京:化學工業出版社,2005:692.

463000駐馬店市食品藥品檢驗所(李啟彬);河南天方藥業股份有限公司(李青麗)