植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)及其對秈稻品質(zhì)改良的研究進展

李丹丹，王偉平 ，肖層林,*

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，長沙 410128；2湖南雜交水稻研究中心，長沙 410125)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是利用分子生物學(xué)技術(shù)，將具有實用價值的外源基因?qū)肓硪环N生物中，改造生物的遺傳物質(zhì)，形成新的生物類型。植物轉(zhuǎn)基因工程的目標主要是實現(xiàn)對作物的抗蟲、抗病、抗逆、耐寒、耐旱及品質(zhì)改良，從而獲得理想性狀的新品系。1983年，Zambryski[1]利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草獲得了首例轉(zhuǎn)基因植物。水稻(Oryza sativa L.)是世界上重要的糧食作物之一。 隨著人們生活水平的日益提高，對稻米品質(zhì)的要求也越來越高，研發(fā)具有某些特定功能的功能性稻米也成為了水稻育種的目標。人們利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已將多種基因轉(zhuǎn)入水稻以改善某些性狀，獲得了一些在抗性、品質(zhì)等方面有明顯提高的轉(zhuǎn)基因水稻材料。至今，國內(nèi)轉(zhuǎn)基因研究已將約200種基因在60多種作物上做過試驗，在水稻方面已成功地選育了一系列轉(zhuǎn)基因品系及材料。1986年Uchimiya等首先獲得卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織[1]。1988年Tofiyama等在粳稻品種中獲得第一批轉(zhuǎn)基因水稻植株[2]；1990年Datta等從秈稻品種Chinsurah Boro II中獲得第一例轉(zhuǎn)基因秈稻植株[3]。水稻已成為單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化的模式植物，為其它禾本科植物的研究奠定了基礎(chǔ)。但是轉(zhuǎn)基因水稻研究還有許多問題亟需解決，包括不同品種基因型差異大、遺傳轉(zhuǎn)化體系不穩(wěn)定、遺傳轉(zhuǎn)化效率低等。

1 植物轉(zhuǎn)基因方法的研究進展

根據(jù)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的原理，轉(zhuǎn)基因方法被分為三類：其一，植物自身生殖系統(tǒng)為媒介的轉(zhuǎn)化方法，如花粉管通道法、浸泡法、細胞轉(zhuǎn)化法等。其二，以質(zhì)粒為載體的間接轉(zhuǎn)化法，如農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。其三，直接轉(zhuǎn)化法，相比前兩種轉(zhuǎn)化方法，直接轉(zhuǎn)化法不用任何載體，如基因槍法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、PEG法、低能離子束介導(dǎo)法、激光微束介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、電泳法和超聲波法等。其中，基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法被廣泛用于水稻轉(zhuǎn)基因研究。

1.1 植物自身生殖系統(tǒng)為媒介的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)

1.1.1 花粉管通道法

基本原理是在植物授粉結(jié)束后，將外源 DNA沿著花粉管通道導(dǎo)入，經(jīng)過珠心通道進入胚囊，對尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞進行轉(zhuǎn)化。柱頭切除法、花粉粒吸入法、柱頭涂抹法等都是行之有效的操作方法。此法操作簡便，易于掌控，不受操作地點限制，在大田、盆栽和溫室中，只要具備有性生殖過程的任何植物都可以進行，能縮短了育種時間，但是受到開花季節(jié)的限制。

1.1.2 浸泡法

利用植物自身的物質(zhì)運轉(zhuǎn)系統(tǒng)，將轉(zhuǎn)化外植體葉子、子房、胚珠、幼穗、胚、花粉粒、幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，通過滲透作用，把外源基因?qū)胧荏w細胞，使外源基因與受體整合、表達。該方法工作效率高，可以進行大批量的受體轉(zhuǎn)化工作，培養(yǎng)技術(shù)簡單，但該方法存在轉(zhuǎn)化率低，重復(fù)性差，篩選和檢測困難等缺點。

1.2 以質(zhì)粒為載體的間接轉(zhuǎn)化法——根癌農(nóng)桿菌法

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化是一種天然的基因遺傳轉(zhuǎn)化方法，將外源基因插入農(nóng)桿菌的質(zhì)粒上，由載體將外源基因轉(zhuǎn)移并整合到植物細胞基因組中。20世紀80年代初開始根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物研究，90年代獲得了轉(zhuǎn)化細胞或轉(zhuǎn)基因植株。由于禾谷類作物不是根癌農(nóng)桿菌的天然寄主，利用農(nóng)桿菌進行遺傳轉(zhuǎn)化曾經(jīng)存在爭議。1994年，Hiei[4]等利用“超雙元”載體，改善培養(yǎng)基成分，在培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮(Acetosyringone)，建立適宜的轉(zhuǎn)化體系，有效地提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻轉(zhuǎn)化頻率，并提供了詳細的分子生物學(xué)證據(jù)和遺傳學(xué)證據(jù)。Raineri[5]等用農(nóng)桿菌菌株A281轉(zhuǎn)化粳稻(Oryza satJvaev，Nipponbare)的成熟胚，獲得到抗卡那霉素的愈傷組織。Chart[6]等用水稻根系和未成熟幼胚作為外植體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻，獲得了可育轉(zhuǎn)基因植株。Southern blot分析表明T-DNA上的基因可以傳遞給后代。陳美芳[7]等將反義Wx基因?qū)?個直連淀粉含量高的傳統(tǒng)秈稻品種綠黃占、清蘆占 11號、三蘆占 7號和特青中，對成熟種子直鏈淀粉含量分析表明，部分轉(zhuǎn)基因水稻植株的T1或T2代種子中的直鏈淀粉含量有不同程度的降低，最低已降至16.52%。陳秀花[8]等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將反義 Wx基因?qū)攵i型雜交稻的保持系中，結(jié)果表明，多數(shù)轉(zhuǎn)基因水稻的直鏈淀粉含量出現(xiàn)不同程度的降低，最低下降至7%左右。

農(nóng)桿菌濃度、共培養(yǎng)侵染方式、水稻基因型、轉(zhuǎn)化受體、選擇標記基因等都是影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)的因素。易自力[9]等對不同的秈稻和粳稻品種進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，秈稻品種在3種培養(yǎng)基(CC，NB，MS)上的平均出愈率和分化率分別為67.2%，42.0%；相比秈稻而言，粳稻的出愈率和分化率都比較高，分別為88.7%，62.5%。農(nóng)桿菌濃度直接影響轉(zhuǎn)化率，濃度過低時，不利于基因的轉(zhuǎn)入；菌液濃度過高，菌體自身易聚結(jié)，影響其在外植體上的附著，而且容易損失愈傷組織，因此找到適合的濃度范圍可以有效地提高愈傷轉(zhuǎn)化率。黃紅梅[10]等在研究農(nóng)桿菌濃度對轉(zhuǎn)化率的影響時發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化率基本保持穩(wěn)定的農(nóng)桿菌菌濃度 OD600為 0.145～0.190，轉(zhuǎn)化率約為79%，超過最大值0.190時，愈傷組織生長受到抑制，死亡愈傷數(shù)增多，選擇培養(yǎng)時出現(xiàn)農(nóng)桿菌污染。外源基因是否導(dǎo)入愈傷組織與根癌農(nóng)桿菌和愈傷組織的共培養(yǎng)時間密不可分。培養(yǎng)時間過長，難以抑制農(nóng)桿菌大量繁殖，容易造成農(nóng)桿菌污染。殷麗青[11]等對影響根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化頻率的研究表明：愈傷組織共培養(yǎng)時間以3 d為宜；在抑制農(nóng)桿菌效果方面，羧芐青霉素優(yōu)于頭孢霉素，250～400 mg/L為比較適宜的濃度。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因常用的方法是共培養(yǎng)法，對共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體系的轉(zhuǎn)化因子進行優(yōu)化非常重要。

1.3 直接轉(zhuǎn)化法

1.3.1 電擊法

借助高壓的電脈沖作用擊穿原生質(zhì)體質(zhì)膜，形成可逆性的瞬間通道，從而使DNA通過小孔進入原生質(zhì)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化方法。Ou—lee[12]等在電擊水稻原生質(zhì)體后獲得了 cat(chloramphenicol aicetyl transferas氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因的瞬間表達。該法的優(yōu)點是操作簡單，轉(zhuǎn)化效率較高，電擊后細胞仍然保持完整性，避免植物細胞釋放核酸，適合于瞬間表達的研究，缺點是容易對細胞膜造成損傷，影響遺傳轉(zhuǎn)化效率。

1.3.2 基因槍法

將外源基因或DNA吸附在金屬微粒上， 利用高壓放電、高壓氣體或火藥爆炸，將金屬微粒高速射入植物受體細胞或組織中從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。吳家道[13]等將抗白葉枯病基因 Xa21利用基因槍技術(shù)導(dǎo)入三系雜交稻恢復(fù)系明恢63和保持系皖B中，獲得轉(zhuǎn)基因水稻系，經(jīng)檢測，用轉(zhuǎn)基因水稻配制兩系雜交到，雜交組著F1含有Xa基因，既抗白葉枯病，又有較大的增產(chǎn)潛力。基因槍法缺點就是試驗成本高、轉(zhuǎn)化頻率低，較難導(dǎo)入大片段基因，拷貝數(shù)多，后代中容易丟失。

2 秈稻遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及優(yōu)化

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是定向改良水稻品種特性，實現(xiàn)高效育種的重要方法，然而秈稻組織培養(yǎng)困難嚴重地限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在秈稻品種改良中的發(fā)展。很多學(xué)者針對秈稻的愈傷遺傳轉(zhuǎn)化體系作了研究，試圖優(yōu)化秈稻組織培養(yǎng)技術(shù)，提高秈稻遺傳轉(zhuǎn)化效率，以促進秈稻細胞工程育種的理論研究與生產(chǎn)應(yīng)用的發(fā)展。

2.1 影響秈稻誘導(dǎo)率的因素

導(dǎo)致秈稻組織培養(yǎng)困難的因素有很多，基因型是影響秈稻愈傷組織誘導(dǎo)的因素之一。沈錦華[14]等研究發(fā)現(xiàn)：各種基因型水稻組織培養(yǎng)能力高低分別為糯＞粳/粳＞粳/秈＞秈型雜交稻＞秈。選擇合適的外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化也是建立秈稻轉(zhuǎn)化體系的重要組成部分，幼穗、花藥、幼胚、花藥和成熟胚都可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的外植體誘導(dǎo)愈傷，但是不同的外植體誘導(dǎo)的愈傷及愈傷分化能力不同。幼穗和幼胚是比較理想的轉(zhuǎn)化受體，具有較高的脫分化與再分化能力，但是受生長季節(jié)限制，無法及時滿足遺傳轉(zhuǎn)化中大量愈傷組織的要求，而成熟胚不受季節(jié)的限制，操作簡單，能夠滿足大量愈傷組織的要求，被廣泛地用作遺傳轉(zhuǎn)化的外植體。

此外，植物激素濃度也是影響秈稻誘導(dǎo)率的重要因素。劉雄倫[15]等研究發(fā)現(xiàn)，各種秈稻品種成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)所需2，4-D濃度在1.0～2.5 mg/L之間，不同 2，4-D濃度處理之間的平均愈傷誘導(dǎo)率存在極顯著差異，說明各個秈稻品種的愈傷誘導(dǎo)均有一個最適 2，4-D濃度。培養(yǎng)基是誘導(dǎo)愈傷組織的物質(zhì)基礎(chǔ)，水解絡(luò)蛋白、脯氨酸、肌醇等都是培養(yǎng)基中的營養(yǎng)添加物。高麗麗[16]等研究發(fā)現(xiàn)，同一種營養(yǎng)添加物對愈傷誘導(dǎo)率在不同秈稻品種間影響差異極顯著。此外，在細胞的懸浮液培養(yǎng)過程中，加入細胞分裂素類物質(zhì)能夠長期培養(yǎng)的秈稻細胞保持胚性。

2.2 影響水稻愈傷組織篩選的因素

誘導(dǎo)后的愈傷組織經(jīng)過篩選后才能進行分化。因此提高篩選過程中愈傷再生頻率是獲得轉(zhuǎn)基因苗的保障。愈傷組織在篩選過程中，很容易發(fā)生褐變，進而嚴重影響成愈率。顧之中[25]等對影響水稻愈傷組織發(fā)生褐變的因素進行研究，結(jié)果表明：水稻基因型的影響在所研究的諸因素中居首位。此外，不同基因型水稻愈傷組織發(fā)生褐變的褐化率差異很大。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的合適的激素配比能提高愈傷組織再生。NAA，KT，BAP，TDZ等都是誘導(dǎo)愈傷組織再生的激素。田文忠[17]等對秈稻愈傷組織再生頻率的研究發(fā)現(xiàn)，無論選用幼胚、成熟種子胚或經(jīng)過繼代培養(yǎng)的愈傷組織，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入NAA 和 KT不但可以顯著提高秈稻愈傷組織的再生頻率，而且還可以提高愈傷組織質(zhì)量，形成致密、較硬，顆粒狀結(jié)構(gòu)的易分化的愈傷組織。

在水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程中，不同的植物或同一植物的不同品種對篩選劑的要求可能不一樣。目前，常用的篩選標記基因是 bar基因(除草劑抗性基因)和hpt基因。周玲艷[18]等對上述兩個篩選標記基因的濃度和效果進行研究，不同水稻對篩選劑濃度要求也不同，當潮霉素濃度為50 mg/L時，粳稻農(nóng)墾58S經(jīng)過15 d左右篩選后，98%的愈傷組織褐化死亡，而秈稻培矮64S愈傷組織全部褐化死亡。

2.3 影響秈稻愈傷組織分化的因素

愈傷組織分化率是保證獲得轉(zhuǎn)基因植株的基礎(chǔ)。秈稻組織培養(yǎng)的愈傷組織分化頻率很低，一般在10%～15%，如何提高秈稻組織培養(yǎng)中植株的分化頻率是目前生物技術(shù)中的亟需解決的難點。

基因型、外植體類型、溫度、外源植株生長調(diào)節(jié)劑、蔗糖質(zhì)量分數(shù)、繼代培養(yǎng)、激素濃度等都是影響秈稻愈傷分化頻率的因素。王慧中[20]等研究了植物激素、蔗糖質(zhì)量分數(shù)、瓊脂質(zhì)量分數(shù)、pH值以及繼代培養(yǎng)對愈傷組織分化率的影響。結(jié)果表明蔗糖2﹪、瓊脂1﹪、PH6.0以及減少繼代培養(yǎng)次數(shù)都有助于愈傷組織分化。楊躍生[21]等認為，在分化培養(yǎng)基中添加較高濃度的 CUSO4可提高綠苗分化率。此外有學(xué)者認為采用兩步分化法[22]及脫水處理均可提高水稻愈傷組織再生率[23]。袁云香[24]等發(fā)現(xiàn)對已分化出綠點的水稻愈傷組織進行三步分化法，能顯著提高成苗率。植物生長調(diào)節(jié)劑也是影響愈傷組織分化頻率的重要因素。對愈傷組織采用一系列的激素篩選，最終得到一組最適合的愈傷分化成苗的激素比是很重要的。陳興春[25]等對分化培養(yǎng)基中的激素濃度研究表明，細胞分裂素ZT和生長素IAA的比率為 100∶1最為合適；分化成苗率最高的培養(yǎng)基為MS + 2.0 mg/L ZT + 0.02 mg/L IAA + 3%蔗糖 + 0.8﹪瓊脂。崔廣榮[26]等研究了微量元素對秈稻愈傷組織分化成苗的影響表明：鐵鹽濃度高低對秈稻愈傷組織成苗率影響非常顯著，最適合的鐵鹽濃度時 0.10 mmol/L，超過或低于此濃度時，盡管有綠點產(chǎn)生但是都不能形成綠苗。硼、碘、鉬三種微量元素對分化成苗影響不大。

在愈傷組織分花前，對其采取恰當方式和適當時間的干燥有助于提高成熟胚的組織分化率。趙成章[27]等研究了干燥處理對水稻愈傷組織的再生及若干生理特性的影響，為干燥處理的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。馬宏敏[28]等采用了濾紙干燥和自然風(fēng)干兩種干燥方法對成熟胚的愈傷組織在分花前進行干燥處理，結(jié)果表明：兩種干燥方法均能顯著提高水稻愈傷組織的分化率，濾紙干燥的最佳處理時間為4 d左右，自然風(fēng)干干燥的最佳處理時間為1 h左右。趙成章[27]等研究認為，對愈傷組織分化前進行干燥處理，不僅能夠吸收愈傷組織內(nèi)的水分，使分化率顯著提高，而且愈傷組織在干燥的濾紙上處于饑餓狀態(tài)，一旦接到新鮮的分化培養(yǎng)基上，有利于愈傷組織細胞對培養(yǎng)基中養(yǎng)分的吸收和利用。

3 轉(zhuǎn)基因技術(shù)對稻米品質(zhì)的改良

3.1 營養(yǎng)品質(zhì)改良

隨著人們生活的日益改善，人們對稻米品質(zhì)及其附加值的要求也越來越高。研究開發(fā)具有某些特定功能的功能性稻米是水稻育種領(lǐng)域較前沿的熱點課題。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，有機地結(jié)合分子標記選擇和常規(guī)育種等技術(shù)，利用Wx，Wx-hp，SBE，ISA，ALK，RSR2等基因，科研工作者已成功創(chuàng)造出外觀品質(zhì)、食味品質(zhì)、營養(yǎng)結(jié)構(gòu)等方面有顯著改良的優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因水稻新品系。

為了改善稻米在蛋白質(zhì)含量和氨基酸平衡方面存在的缺陷，提高稻米中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量，人們常將蛋白質(zhì)中賴氨酸含量較高的豆類蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)入水稻中以改良其營養(yǎng)品質(zhì)。賴氨酸是蛋白質(zhì)含量第一限制性氨基酸，提高賴氨酸含量，可以提高蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化率，改善稻米的品質(zhì)。Zheng[29]等通過 PEG誘導(dǎo)法分別將菜豆和豌豆的球蛋白基因?qū)胨局?在水稻種子的內(nèi)胚乳中表達 ，其中菜豆球蛋白約占內(nèi)胚乳蛋白質(zhì)總量的 4%。Momma[23]等通過電擊法將大豆球蛋白基因(AlaBlb)導(dǎo)入水稻中，使大豆球蛋白的量約占種子蛋白質(zhì)量的4%～5% 達 40～50 mg/g 蛋白質(zhì)。很多學(xué)者除將豆類蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻中外，將其它植物的基因?qū)胨局校酝瓿蓪λ镜鞍踪|(zhì)和氨基酸含量的改良。起登鳳[30]等將通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將馬鈴薯特異水溶性蛋白基因SB401導(dǎo)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株的賴氨酸含量提高了20%以上。

在轉(zhuǎn)基因技術(shù)操作中，研究人員不僅可以將單獨的目的基因?qū)胨局校€可以構(gòu)建包含兩個或兩個以上理想的改良稻米品質(zhì)的基因的載體，將其一起轉(zhuǎn)入水稻中，更方面快捷地改良作物品質(zhì)問題。王為民[31]等利用基因槍法將1個含高賴氨酸蛋白質(zhì)基因和bar基因的植物表達載體，分別導(dǎo)入秈稻中優(yōu)早5號幼胚和龍?zhí)馗成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，經(jīng)檢測種子蛋白質(zhì)含量和賴氨酸含量均有所提高。將改善稻米品質(zhì)與抗蟲基因的兩個基因同時導(dǎo)入同一水稻品種中，既改善了稻米品質(zhì)，有提高了水稻抗蟲能力。孔維文等[32]利用基因工程技術(shù)將CaMU35S啟動子引導(dǎo)的半夏凝集素基因(PTA)和水稻胚乳特異表達啟動子(Glutelin-BI promtoter)引導(dǎo)的馬鈴薯高賴氨酸蛋白基因(SB401)同時轉(zhuǎn)入 1826成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織中，獲得了同時含 PTA和SB401的轉(zhuǎn)基因植株，既提高了1826的抗褐飛虱能力，又提高了賴氨酸含量。

除對水稻中賴氨酸和蛋白質(zhì)含量進行改善以外，很多學(xué)者對水稻中淀粉含量及微量元素含量進行改善。陳美芳[7]等將反義Wx基因?qū)?個直連淀粉含量高的傳統(tǒng)秈稻品種綠黃占、清蘆占11號、三蘆占7號和特青中，對成熟種子直鏈淀粉含量分析表明，部分轉(zhuǎn)基因水稻植株的T1或T2代種子中的直鏈淀粉含量有不同程度的降低，最低已降至16.52%。

3.2 功能品質(zhì)改良

在改善稻米中微量元素方面，瑞士植物研究所Ye利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得了產(chǎn)生β-胡蘿卜素的“金米”，其技術(shù)思路是將維生素A原(β-胡蘿卜素)合成途徑的3個關(guān)鍵酶：八氫番茄紅素合成酶(psy)、細菌八氫番茄紅素去飽和酶(crtI)、番茄紅素 13-環(huán)化酶(1cy)同時導(dǎo)入水稻中，檢測表明類胡蘿I-素已在轉(zhuǎn)基因粳稻臺北309種子中形成，內(nèi)胚乳呈黃色，部分種子內(nèi)胚乳中的類胡蘿h素含量高達1.6 mg/g，其中以β-胡蘿卜素為主。利用水稻種子特異高效表達γ-氨基丁酸合成酶基因，培育富含γ-氨基丁酸稻米的轉(zhuǎn)基因水稻品種，對于改善高血壓患者膳食有重要意義。利用 TMT基因提高轉(zhuǎn)基因水稻中維生素含量的工作，以及提高葉酸含量轉(zhuǎn)基因水稻的研制工作也在進行之中[33]。總之，利用根癌農(nóng)桿菌將水稻不具備的外源基因介導(dǎo)入轉(zhuǎn)化水稻，能篩選獲得一些在品質(zhì)方面有改良的水稻新材料或新品系，該方法能更好地促進水稻育種技術(shù)的發(fā)展。

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