蘋果渣發酵飼料活性物質含量及影響因素研究

任雅萍 薛泉宏 來航線

我國是世界上最大的蘋果生產國，年產蘋果2 000萬噸以上，蘋果汁加工中每年排出蘋果渣近300萬噸，廢棄時造成嚴重的資源浪費和環境污染。作為動物飼料，其蛋白質含量偏低，影響了其他成分的利用。因此采用特定工藝，通過微生物發酵提高蘋果渣中蛋白質含量，將蘋果渣轉化為營養豐富的蛋白質飼料，是解決蘋果渣出路的重要途徑之一。在利用蘋果渣發酵生產飼料蛋白的發酵工藝以及在提高果渣發酵產物的蛋白質含量等方面已進行了一些研究。但單細胞蛋白發酵產物中除蛋白外還有多種酶、活性肽、游離氨基酸等對動物營養具有重要作用的活性成分，這方面的相關研究較少。本文以蘋果渣為原料，重點探索接菌、加氮及滅菌處理對其發酵蛋白飼料中幾種活性物質的影響，旨在為蘋果渣單細胞蛋白發酵飼料營養評價提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

酵母菌（Yeast）、黑曲霉A8（Aspergillus niger A8）及米曲霉（Aspergillus oryzae）由西北農林科技大學資源環境學院微生物資源研究室提供。

1.1.2 原料

干蘋果渣（自然條件下風干），由乾縣海升果汁廠提供。發酵混合原料組成：原料A（蘋果渣∶尿素=19∶1）、原料B（蘋果渣∶油渣粉∶尿素=17∶2∶1）；發酵原料制備：干混合原料∶自來水=1∶2。

1.1.3 培養基

PDA固體培養基。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌懸液制備

向250 ml三角瓶中裝入50 ml PDA培養基滅菌，待冷凝后將活化好的酵母菌懸液1 ml接入該瓶中，用金屬刮鏟涂勻后于28℃下培養3 d，向瓶中加100 ml無菌水制得菌懸液，經血球計數板測定，其活菌數為4.0×109CFU/ml。

1.2.2 黑曲霉A8及米曲霉孢子懸液制備

按方法1.2.1將活化好的黑曲霉A8及米曲霉接入裝有PDA培養基的三角瓶，于28℃下培養5 d，向瓶中加100 ml無菌水制得孢子懸液，經血球計數板測定，其孢子數分別為8.7×108、1.1×109CFU/ml。

1.2.3 固態發酵

1.2.3.1 方案設計

本試驗設發酵劑、滅菌方式及原料組成3個因素。發酵劑設不接菌（CK）、單接酵母菌（Y）、單接黑曲霉（H）、單接米曲霉（M）、酵母菌+黑曲霉（Y+H）、酵母菌+米曲霉（Y+M）6個處理。滅菌方式設自然發酵（CK，原料不滅菌）和滅菌發酵（原料121℃滅菌30 min）2個處理。原料組成：設原料A（蘋果渣+氮素）和原料B（蘋果渣+氮素+油渣）2種類型。試驗共24個處理，每處理重復3次，以未發酵純果渣原料作為對照組。

1.2.3.2 試驗方法

按照1.1.2中的比例配制發酵原料，然后分別稱取48.5 g發酵原料于150 ml組培瓶中，121℃下滅菌30 min，冷卻至室溫，接入發酵劑（單菌接種量為5 ml，混菌各2.5 ml），用滅菌竹簽攪勻，28℃下培養72 h，發酵結束后將樣品在45℃下鼓風烘干并粉碎備用。

1.2.4 發酵產物中活性物質測定

1.2.4.1 游離氨基酸含量測定

稱樣品1.000 g于小三角瓶中，加蒸餾水20 ml，加蓋小漏斗在水浴鍋上沸浴，維持15 min；加飽和CaCl22 ml，100 g/l KH2PO44 ml，待出現白色絮凝物后，充分搖勻過濾，取濾液0.5 ml定容至50 ml，采用茚三酮比色法測定樣品中游離氨基酸含量。

1.2.4.2 活性肽含量測定

將1.2.4.1中的提取液稀釋適當倍數，采用考馬斯亮藍比色法測定樣品中活性肽含量。

1.2.4.3 水溶性蛋白質含量測定

稱樣品0.500 g于小三角瓶中，加蒸餾水10 ml，加蓋小漏斗后在水浴鍋上沸浴，維持15 min，充分搖勻后過濾，將濾液稀釋適宜倍數后，采用考馬斯亮藍比色法測定其水溶性蛋白質的含量。

1.3 結果計算

游離氨基酸發酵增率（⊿f）、接菌增率（⊿i）和滅菌增率（⊿s）采用下式計算：

式中：Cck——分別表示未發酵、未接菌及未滅菌游離氨基酸含量(g/kg)；

Ci——分別為發酵、接菌和滅菌處理后游離氨基酸含量(g/kg)。

活性肽及水溶性蛋白質的發酵增率、接菌增率及滅菌增率計算同游離氨基酸。

2 結果與分析

2.1 發酵產物游離氨基酸含量

2.1.1 自然發酵（見表1）

表1 自然發酵產物游離氨基酸含量及其增率

由表1可以看出，在自然發酵條件下，原料A不接種發酵劑，單靠原料及空氣中微生物自然接種，蘋果渣的游離氨基酸含量僅由5.43 g/kg提高到5.81 g/kg，發酵增率⊿f僅為7.0%，而接種黑曲霉、酵母菌+米曲霉、酵母菌、酵母菌+黑曲霉及米曲霉后，發酵產物中游離氨基酸含量較未發酵純果渣原料有提高，其發酵增率⊿f分別為63.4%、38.3%、22.1%、16.6%及16.4%；與不接種相比，接種引起的游離氨基酸增率⊿i為8.8%～52.7%。原料B與之類似，特別是在接種酵母菌加米曲霉時，游離氨基酸含量的發酵增率⊿f及接種增率⊿i分別為126.3%及94.5%，即原料中加入油渣能大幅度提高酵母菌+米曲霉發酵產物中游離氨基酸含量。

2.1.2 滅菌發酵（見表2）

表2 滅菌發酵產物游離氨基酸含量及其增率

由表2可以看出，在滅菌條件下，發酵能大幅提高發酵產物游離氨基酸含量。在原料A中，向蘋果渣接種各供試菌株所得發酵產物游離氨基酸含量為7.31～14.54 g/kg，發酵引起的游離氨基酸增率⊿f為89.1%～167.8%，其中不接菌處理游離氨基酸的增率⊿f為34.6%，與固態發酵期間黑曲霉孢子落入并生長有關（樣品烘干處理時在CK中發現有黑曲霉生長）。在不同發酵劑處理中，接菌引起的游離氨基酸增率⊿i為40.5%～98.9%，其中接種酵母菌+米曲霉時游離氨基酸含量較對照增加98.9%，增幅明顯。在原料B中，發酵產物中游離氨基酸含量高達10.06～17.96 g/kg，與未發酵原料相比，發酵增率⊿f為85.3%～230.8%，接菌引起的游離氨基酸增率⊿i為1.3%～78.5%，以黑曲霉接種處理接菌增率最高。

2.1.3 原料滅菌及添加油渣對發酵產物中游離氨基酸含量的影響

由表1、表2比較及表2中的滅菌增率⊿s可以看出，滅菌條件下，發酵產物游離氨基酸含量均明顯大于未滅菌自然發酵。在原料A中，自然發酵與滅菌發酵產物的游離氨基酸含量分別為5.81～8.87 g/kg與7.31～14.54 g/kg，其滅菌增率⊿s為21.8%～115.4%，滅菌處理增幅明顯，說明原料滅菌能顯著提高發酵產物游離氨基酸含量，原料B與原料A類似。

此外，由表1、表2可以看出，在自然發酵的酵母菌+黑曲霉及酵母菌+米曲霉處理中，原料B發酵產物的游離氨基酸含量分別是原料A的1.5及1.6倍；在滅菌發酵中，單接黑曲霉、酵母菌+黑曲霉混接處理的游離氨基酸含量及發酵增率⊿f也呈現B原料高于A原料的趨勢。結果表明，向原料中添加油渣有助于提高發酵產物中的游離氨基酸含量及發酵增率。

2.2 發酵產物活性肽含量

2.2.1 自然發酵（見表3）

表3 自然發酵產物活性肽含量及其增率

由表3可以看出，原料A在不滅菌和不接種發酵劑的自然條件下，靠原料、空氣及原料中的微生物自然接種，可以使蘋果渣的活性肽含量由0.20 g/kg增加到0.30 g/kg，發酵增率⊿f為50.0%；接種酵母菌+米曲霉、酵母菌+黑曲霉、黑曲霉、米曲霉及酵母菌后，發酵產物中活性肽含量的發酵增率⊿f分別為195.0%、150.0%、145.0%、110.0%及95.0%;與不接種對照處理相比,接種引起的活性肽增率⊿i為30.0%～96.7%。原

料B與之類似，特別是在接種酵母菌+米曲霉時，活性肽含量的發酵增率⊿f及接種增率⊿i分別為220.0%及73.0%，增幅明顯。

2.2.2 滅菌發酵(見表4)

表4 滅菌條件下發酵產物活性肽含量及其增率

由表4看出，在滅菌發酵中，接菌處理能大幅提高發酵產物活性肽含量。在原料A中，向蘋果渣接種各供試菌株發酵產物中活性肽含量為0.64～0.82 g/kg，米曲霉、黑曲霉、米曲霉+酵母菌及黑曲霉+酵母菌處理與不接菌對照活性肽差異顯著；發酵引起的活性肽增率⊿f為105.0%～310.0%，其中不接菌處理活性肽的增率⊿f為105.0%；在不同發酵劑處理中，接菌導致的活性肽增率⊿i為56.1%～100.0%，其中接種酵母菌+黑曲霉混菌時活性肽含量較對照增加100.0%，增幅明顯。在原料B中，發酵產物中活性肽含量高達0.57～0.96 g/kg，發酵導致的增率⊿f為185.0%～380.0%，接菌引起的活性肽增率⊿i為38.6%～68.4%。

2.2.3 原料滅菌及添加油渣對發酵產物中活性肽含量的影響

由表4中滅菌增率⊿s可以看出，滅菌條件下發酵產物活性肽的含量均明顯大于自然發酵產物活性肽含量，原料A和原料B滅菌增率⊿s分別為27.1%～64.3%和25.0%～81.1%，說明滅菌能顯著提高發酵產物活性肽含量。

由表3、表4可以看出，在未滅菌條件及滅菌條件下，原料B發酵產物活性肽含量與原料A差異不大，原料B的發酵增率略高于原料A。由此可見，原料中添加油渣對提高發酵產物活性肽含量及發酵增率有一定影響。

2.3 發酵產物水溶性蛋白質含量

2.3.1 自然發酵（見表5）

表5 自然發酵產物水溶性蛋白質含量及其增率

由表5可以看出，在自然發酵條件下，原料A不接種發酵劑，僅靠原料及空氣中的微生物自然接種，就可以使蘋果渣的水溶性蛋白質含量由2.08 g/kg提高到2.54 g/kg，增率⊿f為22.1%；接種酵母菌+米曲霉、米曲霉、酵母菌+黑曲霉及黑曲霉后，發酵產物中水溶性蛋白質含量較未發酵純果渣分別提高172.6%、151.4%、119.2%及57.2%；與不接種對照處理相比，除接種酵母菌后水溶性蛋白質含量較對照下降1.6%外，其余發酵劑接種引起的水溶性蛋白質增率⊿i為28.7%～123.2%。原料B與之類似，特別是在接種米曲霉（M）時，水溶性蛋白質含量的發酵增率⊿f及接菌增率⊿i分別為230.3%及161.2%，增幅明顯。

2.3.2 滅菌發酵（見表6）

由表6可以看出，在滅菌發酵中，發酵能顯著增加產物中水溶蛋白含量。在原料A中，發酵導致的水溶性蛋白質增率⊿f為130.3%～569.2%，其中不接菌處理水溶性蛋白質的增率⊿f為130.3%，與固態發酵期間曲霉孢子落入并生長有關。接菌處理能大幅提高發酵產物水溶性蛋白質含量，向蘋果渣接種各供試菌株發酵所得水溶性蛋白質含量為5.94～13.92 g/kg，與不接菌對照組差異顯著（P＜0.05），接菌導致的水溶性蛋白質增率⊿i為24.0%～190.6%，其中接種酵母菌+米曲霉時水溶性蛋白質含量含量較對照增加190.6%，增幅明顯。在原料B中，發酵產物中水溶性蛋白質含量為4.85～14.87 g/kg，增率⊿f為133.2%～614.9%；與不接菌對照組相比，接菌導致的水溶性蛋白質增率⊿i為62.7%～206.6%，差異顯著（P＜0.05）。

表6 滅菌發酵產物水溶性蛋白質含量及其增率

2.3.3 原料滅菌及添加油渣對發酵產物中水溶性蛋白質含量的影響

由表6中滅菌增率⊿s可以看出，滅菌條件下發酵產物水溶性蛋白質的含量均明顯大于自然發酵產物水溶性蛋白質含量，原料A和原料B的滅菌增率⊿s分別為80.9%～230.3%和54.4%～323.6%，增幅明顯，說明滅菌處理能顯著提高發酵產物水溶性蛋白質含量。

由表5、表6可以看出，在自然及滅菌條件下，原料B與原料A發酵產物水溶性蛋白質含量存在一定差異。在自然發酵中，單接酵母菌、米曲霉時，原料B中水溶性蛋白質含量是原料A的1.4、1.3倍，滅菌發酵與之類似。此外，滅菌發酵中原料B、原料A的發酵增率⊿f分別為133.2%～614.9%、130.3%～569.2%，即原料B的發酵增率高于原料A，表明原料中添加油渣有助于提高發酵產物中的水溶性蛋白質含量及發酵增率。

3 結論與討論

本研究發現，以蘋果渣為主要原料進行固態發酵可以顯著提高發酵產物中水溶性蛋白質、游離氨基酸及活性肽含量；發酵產物中上述活性成分含量高低與發酵中微生物作用、原料組成、供試菌株種類及滅菌處理等因素密切相關。

目前,動物蛋白質營養研究已經由粗蛋白營養研究、氨基酸營養研究發展至肽營養研究階段。已有研究表明，在動物對蛋白質的吸收與利用過程中，游離氨基酸是最直接的吸收形式，肽（尤其是小肽）也起到十分重要的作用。施用暉等報道，在蛋雞日糧中添加0.3%的大分子酪蛋白肽后，提高了蛋雞的產蛋率和飼料轉換效率；許金新等報道，通過肽與游離氨基酸吸收部位的互補,可達到氨基酸的最優攝取，小肽作為生理調節物在動物的消化代謝中起著非常重要的作用。單體氨基酸能夠取代完整蛋白的數量是有限的,直接吸收較大分子肽也是必要的，因而可通過游離氨基酸及肽類的添加來提高蛋白質的吸收利用率。

目前，蘋果渣發酵蛋白飼料研究的重點是提高發酵產物中蛋白質含量，而對發酵飼料中游離氨基酸研究很少，尚無關于發酵飼料中活性肽的研究報道。本文重點研究了以蘋果渣為原料發酵所得發酵飼料中水溶性蛋白質、活性肽及游離氨基酸含量及影響因素，其結果可為果渣發酵飼料工藝設計及品質評價研究提供新的科學依據。

文中提及的“水溶性蛋白質”是指發酵產物沸水提取時，濾液中用考馬斯亮藍法測定的蛋白質含量；“活性肽”則指水溶性蛋白質提取液加入沉淀劑，沉淀大分子真蛋白后濾液中殘留的小分子肽。鑒于目前尚無水溶性蛋白及活性肽的標準測定方法，本研究暫將上述方法的測定結果定義為發酵產物水溶性蛋白質及活性肽含量，其可行性有待進一步研究確定。