高鈣日糧對農安籽鵝不同部位肌肉μ-Calp ain mRNA表達量的影響

王劍 孫會

鈣蛋白酶(Calpain)是存在于細胞質中的依賴于Ca2+的中性半胱氨酸內肽酶，主要存在于肌纖維Z盤附近和肌質網膜上。目前已證實哺乳動物體內鈣蛋白酶存在13種同工酶，包括7種無組織特異性表達的Calpain1、2、4、5、7、10和12；6種組織特異性表達的Calpain3、6、8、9、11和13[1]，其中有關Calpain1和Calpain2的研究最為深入。Calpain1和Calpain2兩種異構體根據鈣蛋白酶表現半最高活性所需的Ca2+濃度的不同又稱為μ-Calpain和m-Calpain。其中μ-Calpain所需的Ca2+為1～12 μmol/l，而m-Calpain則需要250～750 μmol/l[2]。由于m-Calpain需要較高濃度Ca2+激活，而宰后肌肉中Ca2+濃度很難達到，所以在肌肉嫩化過程中μ-Calpain參加反應并對肌肉嫩度有改善作用，是肌肉蛋白降解的重要酶類。近些年μ-Calpain基因作為肉品質的候選基因在豬、牛、羊的研究中已經有所報道，而關于家禽類動物的研究報道并不多。本試驗主要研究高鈣日糧對鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量的影響，從而確定在日糧中添加鈣的適宜劑量以改善鵝肉品質。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用體重近似、性別一致、健康狀況良好的8周齡農安籽鵝120只。預飼期7 d，試驗期28 d。

1.2 試驗設計

本試驗采用2因素4水平的試驗設計方法。設4個處理組，對照組飼喂基礎日糧(Ca 0.6%)，試驗1組(Ca 0.9%)，試驗2組(Ca 1.2%)，試驗3組(Ca 1.5%)。鈣源均采用丙酸鈣。每個處理3個重復，每個重復10只鵝。

1.3 日糧配制（見表1）

表1 日糧組成及營養水平

采用玉米-豆粕型日糧，日糧參照美國NRC(1994版)禽的營養需要進行設計，并采用粉料形式進行配制。

1.4 飼養管理

在試驗期內，采用地面分圈散養。每日飼喂三次(早8:00，中午11:30，晚4:30)，每次喂料量以吃飽后略有剩余為準，記錄采食量，自由飲水。

1.5 樣本采集及各組織總RNA的提取

本試驗分別于7、14、21、28 d進行屠宰，取胸肌、腿肌大約100 mg置于凍存管內在液氮罐中暫存，之后轉入-80℃冰箱中保存。分別取4組鵝胸肌和腿肌肉各50 mg，按RNA抽提試劑盒的使用說明分別提取胸肌和腿肌的總RNA。利用核酸蛋白儀和瓊脂糖電泳測定RNA濃度和純度，RNA濃度要求在A260/A280 1.8～2.0之間可以使用，提取的總RNA置于-80℃冰箱中保存。

1.6 引物的設計與合成

μ-Calpain基因與β-actin基因序列從GenBank中檢索獲得,基因號分別為NM_205303和L08165。用primer軟件設計，探針（Probe）5'CAATGGCTCCGGTATGTGCAAGGC3'，其中5'端標記FAM，3'端標記TEMRA，引物與探針由北京華大基因工程公司合成。其引物序列見表2。

表2 基因的引物的序列和擴增大小

1.7 實時熒光定量PCR

反應參照TOYOBO公司ReverTra Ace Qpcr RT Kit試劑盒進行，取肌肉組織中的總RNA 2 μl、RT Buffer 4 μl、RT Enzyme Mix 1μl、Primer Mix 1 μl，其余試劑按試劑盒要求加入PCR管中，反應體系為20μl，反應程序為：37℃15 min、98℃5 min。反應產物置于-20℃冰箱保存。RT反應結束后進行PCR反應，將RT反應的產物應用為PCR模板。實時熒光定量PCR方法參照實時熒光定量MaximaProbe/ROX qPCR Master Mix，使用ABI step one_plus Real-time RCR System進行實時熒光定量PCR，PCR擴增反應的反應體系為25 μl。PCR反應程序為：95℃預變性10 s、95℃變性5 s、45.5℃退火20 s、72℃延伸30 s，40個循環。反應后產物做瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.8 統計分析

試驗數據采用SPSS（16.0）軟件進行雙因素方差分析，用Duncan's法多重比較分析組間差異顯著。試驗數據均用平均值±標準差(Mean±SD)表示。

2 結果與分析

2.1 樣本總RNA提取結果(見圖1)

組織提取的總RNA經紫外分光光度計檢測，A260/A280在1.8～2.0之間，由圖1可知，RNA分子條帶清晰、完整性好、RNA降解低、無DNA污染，能滿足試驗要求。

圖1 樣本總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 建立標準曲線

以不同拷貝數標準品重組質粒模板的對數為橫坐標，以PCR反應過程中出現熒光信號的初始循環數(Ct)為縱坐標，分別作出β-actin基因與μ-Calpain基因的標準曲線。

β-actin基因標準曲線在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內構建，β-actin基因標準曲線方程Y=-3.233x+36.931，回歸系數0.995，擴增效率103.841。其中Y為Ct值，X為模板量的對數值。標準曲線的擴增效率在理想的90%～105%的范圍內，試驗重復性好（見圖2）。

μ-Calpain基因標準曲線在模板濃度梯度為10-3～10-10的范圍內構建，μ-Calpain基因標準曲線方程Y=-3.265 3x+31.343，回歸系數0.986，擴增效率102.204。其中Y為Ct值，X為模板量的對數值。標準曲線的擴增效率在理想的90%～105%的范圍內，試驗重復性好(見圖3)。

圖2 β-actin基因標準曲線

圖3 μ-Calpain基因標準曲線

2.3 目的基因RT-PCR擴增曲線

組織Total RNA經過反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增反應，反應后系統根據熒光值的變化規律，自動生成反應循環數與熒光量變化的擴增反應動力學曲線(見圖4)。

圖4 μ-Calpain mRNA熒光定量PCR循環數與熒光強度的關系曲線

2.4 高鈣日糧對鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量的影響（見表3）

由表3可知，高鈣日糧對鵝胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表達量無顯著影響(P＞0.05)，在不同鈣水平下，胸肌μ-Calpain mRNA表達量高于腿肌μ-Calpain mRNA表達量。

表3 高鈣日糧對鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量的影響

2.5 不同屠宰時間對鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量的影響（見表4）

表4 不同屠宰時間對μ-Calpain mRNA表達量的影響

由表4可知，不同屠宰時間對胸肌μ-Calpain mRNA表達量影響極顯著，且在屠宰第21 d與屠宰第7、14、28 d之間差異極顯著(P＜0.01)，第7、14、28 d之間差異不顯著。胸肌的μ-Calpain mRNA表達量均高于腿肌μ-Calpain mRNA表達量。

3 討論

3.1 高鈣日糧對鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量的影響

本試驗結果表明，添加不同鈣水平日糧對鵝胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表達量無顯著影響(P＞0.05)。其原因可能是隨著鈣水平的提高，機體中吸收Ca2+含量也逐漸增加，然而機體中Ca2+的吸收存在一定的閾值，通過體內代謝與相關激素的調節，使得鈣含量保持動態的平衡。當機體鈣攝入量不超過這一閾值時，機體鈣含量相對增加，從而提高了肌肉μ-Calpain mRNA表達量。但當機體攝入鈣過多的時候，吸收機制受到阻礙，過多的鈣隨著糞便與尿一同排出體外。另外也有可能在高鈣日糧條件下，吸收較多的Ca2+也有可能激活了Calpastatin，從而抑制了μ-Calpain的活性，即μ-Calpain mRNA表達量無顯著變化。在不同鈣水平日糧條件下，胸肌μ-Calpain mRNA表達量高于腿肌μ-Calpain mRNA表達量。這與劉安芳[3]研究結果相一致。劉安芳在雞不同組織中測定鈣蛋白酶表達量的試驗結果表明，胸肌μ-Calpain mRNA的表達量顯著高于腿肌的表達量。與肖蘞[4]的研究結果相似，在前42 d測定山地烏骨雞不同組織μ-Calpain表達量的結果顯示，胸肌的表達量高于腿肌的表達量。其可能的原因是由于隨著鈣水平的提高，大量Ca2+的攝入造成胸肌中Ca2+的沉積量要大于腿部肌肉Ca2+的沉積量，造成了從整體上來看胸肌表達量高于腿肌的表達量。

3.2 不同屠宰時間對鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量影響

本試驗研究結果表明，第21 d屠宰的胸肌μ-Calpain mRNA表達量與第7、14、28 d屠宰之間差異極顯著(P＜0.01)，而第7、14、28 d屠宰的胸肌μ-Calpain mRNA表達量無顯著差異(P＞0.05)。不同屠宰時間對腿肌μ-Calpain mRNA表達量無顯著影響(P＞0.05)。這可能因為不同的飼喂時間，機體吸收的Ca2+在胸肌沉積量有所不同，導致對μ-Calpain mRNA表達量影響不同，而腿肌沉積的Ca2+量無明顯差異，因此對μ-Calpain mRNA表達量無顯著影響。

本試驗結果顯示，鵝不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量是不同的，即胸肌μ-Calpain mRNA表達量均高于腿肌，以第21 d屠宰胸肌與腿肌的差距最大。這可能是由于機體吸收的Ca2+在不同部位肌肉沉積量是不同的，因而刺激μ-Calpain活性的大小不同，即不同部位肌肉μ-Calpain mRNA表達量不同，胸肌μ-Calpain mRNA表達量高于腿肌。

4 結論

添加不同水平丙酸鈣的日糧對鵝胸肌和腿肌μ-Calpain mRNA表達量無顯著影響。在添加0.9%Ca2+時，胸肌μ-Calpain mRNA表達量達到比較高的水平，1.2%Ca2+對腿肌μ-Calpain mRNA表達量影響較大；而以第14 d屠宰對鵝腿肌μ-Calpain mRNA表達量影響最大，第21 d屠宰對鵝胸肌μ-Calpain mRNA表達量影響最大。

[1] Sorimachi H,Ono Y.Physiological function of calpains[J].Biochemistry，1997，328:721-732.

[2] Sorimachi H,Kinbara K,Kimura S,et al.Muscle-specific Calpain,p94,responsible for limb girdle muscular dystrophy type 2A associates with connection through IS2,a p94 specific sequence[J].Journal of Biological Chemistry,1995,270:31158-31162.

[3] 劉安芳，朱慶，劉益平，等.鈣蛋白酶基因在雞不同組織和品種中的表達差異[J].中國畜牧雜志，2007，43（19）:4-7.

[4] 肖蘞，張增榮，黃毅，等.山地烏骨雞不同組織中CAPN 1基因表達的發育性變化[J].四川畜牧獸醫，2010，5（03）:34-37.