P2Y2受體在人涎腺及腺樣囊性癌中的表達

高 璐,柴松嶺,張福胤

(1.大連醫科大學口腔醫學院 遼寧大連 116044;2.大連醫科大學附屬第一醫院 口腔科遼寧 大連 116011)

P2Y2受體在人涎腺及腺樣囊性癌中的表達

高 璐1,柴松嶺1,張福胤2

(1.大連醫科大學口腔醫學院 遼寧大連 116044;2.大連醫科大學附屬第一醫院 口腔科遼寧 大連 116011)

[目的]探討P2Y2受體在涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)中表達的臨床意義。[方法]應用免疫組織化學方法檢測P2Y2受體在 49例 SACC和腫瘤周邊涎腺組織中的表達及分布,利用顯微鏡圖像分析技術測定 P2Y2受體表達的平均灰度值,統計學分析兩組該受體表達量的差異。[結果]SACC中P2Y2受體表達的平均灰度值為 12.73±7.59,顯著高于腫瘤周邊涎腺組織的 3.76±1.82(P＜0.05)。SACC實性型的表達平均灰度值高于腺樣 -管狀型,Ⅲ～Ⅳ期高于Ⅰ～Ⅱ期,神經侵襲型高于非神經侵襲型,以上分組中兩組間差異均具有統計學意義。[結論]SACC中 P2Y2受體表達與腫瘤的惡性程度呈正相關性。

涎腺腫瘤;腺樣囊性癌;P2Y2受體;ATP;免疫組織化學

嘌呤受體 P2Y是一類 G蛋白偶聯受體,具有七次跨膜結構,迄今已從人體組織細胞中克隆出 9種P2Y受體亞型,在體內各種組織廣泛分布,功能各異。不同亞型 P2Y受體通過 G蛋白激活不同胞內信號傳導通路,執行特定的生理功能。大量文獻報道絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)通路在細胞生長、惡性轉化及侵襲轉移中起關鍵作用,而 P2Y受體活化可以激活 MAPK信號通路,并促進前列腺癌細胞的體外侵襲[1];研究證實高濃度的ATP通過活化P2Y1受體誘導人小腸上皮癌細胞凋亡,而低濃度的 ATP或 UTP通過刺激P2Y2受體誘導其增殖,故認為嘌呤受體的活化或功能降低可以部分介導上皮癌細胞的增殖和凋亡[2]。目前,關于 P2Y受體在涎腺上皮性腫瘤中發揮的作用尚缺乏研究。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集臨床涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)石蠟病理標本 49例,患者年齡介于 40～70歲。其中,男 23例,女 26例;腮腺腫瘤 22例,頜下腺腫瘤 11例,舌下腺腫瘤 3例,腭部及其它小涎腺腫瘤 13例;49例石蠟標本均有腫瘤周邊正常腺體組織。SACC標本來自大連醫科大學附屬第一醫院口腔頜面外科病房 1995年 ～2010年手術病例,所有標本均經過病理科確診。

1.2 主要試劑

P2Y2受體一抗為兔抗人多克隆抗體,購自 Santa Cruez公司。免疫組化 SP檢測試劑盒、檸檬酸組織抗原修復液、DAB顯色劑均購自福州邁新生物技術開發有限公司。主要試劑的配制：P2Y2受體抗體稀釋度為 1∶50。

1.3 分 組

第 1組：人正常涎腺組織 49例;第 2組：涎腺腺樣囊性癌 49例。SACC進行分組：A組,根據 WHO(1991)病理分型：A1組：腺樣 -管狀型 32例;A2組：實性型 17例。B組,根據 UICC(2002)TNM臨床分期：B1組：Ⅰ ～Ⅱ期 36例;B2組：Ⅲ ～Ⅳ期 13例。C組,根據腫瘤細胞是否侵犯神經(即發現神經受侵襲或癌細胞包繞神經生長判定為陽性)：C1組：非神經侵襲型 35例;C2組：神經侵襲型 14例。

1.4 免疫組化染色和光鏡下觀察結果

在 200倍視野下,每張切片在正常涎腺組織及腫瘤中分別隨機選取 10個視野,測定每個視野的累積灰度值(d)和組織面積(s),用總累積灰度值(D)除以總組織面積(S),計算出每例正常涎腺組織及腺樣囊性癌的平均灰度值(x)。

1.5 統計學方法

采用 SPSS 11.5統計軟件對所得數據進行統計學分析。計量數據以均值 ±標準差(±s)表示,P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結 果

2.1 P2Y2受體在人正常涎腺組織中的表達

人正常涎腺組織中,腮腺 22例,頜下腺 11例,舌下腺 3例,腭部及其它小涎腺 13例。P2Y2受體表達主要分布在導管細胞和腺泡細胞(以漿液腺腺泡為主)的胞核及核膜中,核膜著色較深,呈棕褐色,核內著色不均勻,細胞漿中亦有少量表達,呈不均勻的淺棕色;梭形肌上皮細胞未見表達(圖 1)。P2Y2受體在 49例正常涎腺組織中表達的平均灰度值為3.76±1.82。

2.2 P2Y2受體在 SACC中的表達

P2Y2受體主要分布在未分化、體積較小、核較大且異形性明顯的基底樣和導管樣上皮性腫瘤細胞的胞核、核膜及胞漿處,其中核異形性明顯的腫瘤細胞的胞核及核膜著色最深,呈均勻的深棕色,胞漿成分較少,著色較淺,呈淺棕色;導管樣腫瘤細胞和腺泡樣腫瘤細胞主要表達在細胞核的核膜上,呈黃棕色,核內及胞漿著色不均,呈淺黃棕色;肌上皮樣腫瘤細胞幾乎無表達(圖 2～4)。P2Y2受體在 SACC中表達的平均灰度值為 12.73±7.59,高于在正常腺體組織中的表達量,差異具有顯著性意義(P＜0.05)(表 1)。

表 1 P2Y 2受體在人正常涎腺組織及SACC中表達量的比較Tab 1The expression of P2Y2 in normal salivary gland and SACC

2.2.1 病理分型：在腺樣型 SACC中,P2Y2受體主要表達在篩孔狀結構的上皮性腫瘤細胞中,核及核膜著色較深,呈黃棕色,胞漿著色較淺,呈不均勻的淺棕色;形成篩孔狀的肌上皮樣腫瘤細胞及間質成分幾乎無表達(圖 2)。在管狀型 SACC中,P2Y2受體主要表達在導管內襯樣上皮性腫瘤細胞的核膜處,呈黃棕色,核內及胞漿著色不均,呈淺棕色;包繞其周圍的腫瘤性肌上皮細胞無表達(圖 3)。在實性型 SACC中,P2Y2受體表達在基底細胞樣腫瘤細胞的核及核膜中,其中分化較差,核異形性明顯的腫瘤細胞著色最深,呈深棕色,胞漿成分少,著色淺,呈不均勻的黃棕色(圖 3)。 A1組(腺樣 -管狀型)和 A2組(實性型)SACC的平均灰度值分別為 8.81±1.31和 20.09±9.01,后者表達量高于前者,差異有顯著性意義(P＜0.05)(表 2)。

圖1 P2Y 2受體在人正常涎腺組織中免疫組化染色(800×)箭頭 a為肌上皮細胞,b為腺泡細胞,c為導管細胞Fig 1 The expression of P2Y2 in normal salivary gland(800×)▲amyoepithelial cell,▲b acinar cell,▲c ductal cell

圖2 P2Y2受體在人SACC腺樣(篩狀)型中免疫組化染色(400×)箭頭 a為肌上皮樣腫瘤細胞,b為圓型,卵圓形或不規則形腫瘤細胞Fig 2 The expression of P2Y2 in the sieve type of SACC(400×)▲amyoepithelial tumer cell,▲b irregular tumer cell

圖3 P2Y2受體在 SACC管狀型中的免疫組化染色(400×)箭頭 a為肌上皮樣腫瘤細胞,b為導管樣腫瘤細胞Fig 3 The exp ression of P2Y2 in the tubu lar type of SACC(400×)▲amyoepithelial tumer cell,▲b ductus tumer cell

圖4 P2Y2受體在 SACC混合型(腺樣,管狀,實性)中免疫組化染色(400×)箭頭a肌上皮樣腫瘤細胞,b為導管樣腫瘤細胞,c為體積較小,核異形性明顯的腫瘤細胞Fig 4 The expression of P2Y2 in the solid type of SACC(400×)▲amyoepithelial tumer cell,▲b irregular tumer cell,▲c irregular tumer cell.

2.2.2 臨床分期：B1組(Ⅰ ～Ⅱ期)SACC以腺樣 -管狀型為主,腫瘤性肌上皮成分較多;B2組(Ⅲ ～Ⅳ期)SACC以實性基底樣腫瘤細胞為主,肌上皮樣腫瘤細胞較少。P2Y2受體在二者中表達的平均灰度值分別為 10.33±5.57和 19.49±8.51,后者表達量高于前者,差異有顯著性意義(P＜0.05)(表 2)。

2.2.3 神經侵襲情況：在神經受侵的 SACC中,上皮性腫瘤細胞大多排列成團片狀或小條索狀,P2Y2受體主要表達在上皮性腫瘤細胞的胞核、核膜及胞漿中,侵入和包繞神經纖維的腫瘤細胞著色較深,核及核膜呈深黃棕色,胞漿呈不均勻的黃棕色;腫瘤性肌上皮細胞幾乎無表達。受侵襲的神經纖維束中亦有 P2Y2受體的表達。P2Y2受體在 C1組(非神經侵襲型)和 C2組(神經侵襲型)SACC中表達的平均灰度值分別為 10.65±5.34和 18.02±9.78,后者表達量高于前者,差異有顯著性意義(P＜0.05)(表2)。

表 2 P2Y2受體在涎腺腺樣囊性癌中表達量的比較Tab 2The expression of P2Y2 in SACC

3 討 論

3.1 ATP受體

自 1929年 Lohmann等發現ATP分子以來,ATP長期被認為是一種重要的能量物質。1953年,Holton等發現神經末梢可以釋放 ATP后,對于腺苷酸和腺苷藥理學和組織反應方面的報道逐漸增多,ATP作為一種神經遞質逐漸被揭示。既然 ATP是一種遞質,那么在生物體內必然存在其相應的受體。1978年,Burnstock等發現了嘌呤受體并將其分為P1和 P2受體兩大類,P1受體主要的天然配體是腺苷,又稱腺苷受體;P2受體是一類 ATP受體,根據組織反應的類型和激動劑作用效力順序,將其分為P2X(離子通道受體)和 P2Y(G蛋白偶聯受體)。迄今已從人體組織細胞克隆出 9種 P2Y受體,分別是P2Y1,2,4,6,11,12,13,14,15受體,空缺的數字是一些僅在非哺乳動物體內發現或功能還不明確的受體[3]。

P2Y受體由 308～377個氨基酸組成,糖基化后分子量為 41～53KD,是一種典型的 G蛋白偶聯受體,N端在胞外,C端在胞內,不同的亞型 N、C端有很大差別。P2Y受體在機體內很多組織中均有表達,與其執行的生理功能相適應。

細胞外核苷酸激活 P2Y受體能使血管舒張,心跳減慢;在 P2Y12受體介導下,ADP通過抑制腺苷酸環化酶活性,激活 Ca2+釋放,引起血小板聚集效應;P2Y受體家族在調節 Cl-等電解質平衡和維持細胞極性中亦起到重要作用[4];在神經系統中,P2Y4和P2Y12受體可以抑制 M型 K+通道和 N型 Ca2+通道,從而影響動作電位傳遞以及神經遞質釋放[5];在脊髓,ADP通過 P2Y1受體介導參與調控中樞運動模式;在免疫系統,免疫細胞表面表達的 P2Y受體可以調節免疫細胞對胞外核苷酸的趨化性[6];P2Y受體還可促進細胞增殖,通過與 ATP的相互作用促進細胞由 G1期到 S期的過渡。因此,進一步研究P2Y受體家族,對促進心血管系統、免疫系統、神經系統的研究,以及對癌癥治療和疾病防治都具有重要意義。

3.2 P2Y2受體在人正常涎腺組織中的表達

研究表明,涎腺腺泡及導管細胞上有多種嘌呤受體亞型,分別介導不同的生理反應[7]。Camden等動物實驗證明,如果分離成年動物的大涎腺細胞,進行體外培養,P2Y2受體就會大量增加;將小鼠的頜下腺導管結扎,萎縮的頜下腺組織中 P2Y2受體的表達較正常腺體增加,當將導管結扎解除后,P2Y2受體的表達恢復正常。以上研究說明涎腺組織細胞的損傷修復可能與 P2Y2受體的表達有關。

相關資料報道,在大鼠頜下腺細胞中,P2Y2受體激動劑所致的 Ca2+離子動員以生后早期的反應最大,成年大鼠細胞的反應明顯降低,提示 P2Y2受體在大鼠正常涎腺組織細胞中存在發育性改變[8],與大鼠涎腺細胞的分化具有相關性。本實驗首次發現了 P2Y2受體在人正常涎腺組織中也有表達,其主要分布在導管細胞的核膜及胞漿處,而分化較好的肌上皮細胞幾乎無表達,表明了 P2Y2受體可能與人涎腺組織細胞的分化具有相關性。實驗還發現,P2Y2受體在人正常涎腺組織中的表達明顯低于在SACC中的表達,兩者差別具有非常顯著性意義。從涎腺腫瘤的組織發生學來說,SACC主要來自于閏管儲備/干細胞,如果說腫瘤細胞是分化障礙和異常的結果,可推測 P2Y2受體可能在 SACC發生機制中發揮一定的作用,這需要進一步的研究。

3.3 P2Y2受體在 SACC中的表達

目前,國內外關于嘌呤受體 P2Y的活化與腫瘤進展之間關系的研究甚少。相關文獻報道,P2Y受體在不同活化狀態下會產生不同效應,且涉及到多種 MAPK信號傳導通路。持續 P2Y受體活化可以抑制前列腺癌細胞的體外生長,其中有細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK 1/2)及 P38激酶通路的參與,并且這種生長抑制程度遠大于調亡程度,因而凋亡并非生長抑制的主要因素[9];短暫 P2Y受體活化可抑制前列腺癌細胞集落形成,促進前列腺癌細胞的體外侵襲[10],ERK 1/2通路在其中起重要作用。本研究結果顯示,P2Y2受體在實性型 SACC中的表達量明顯高于腺樣 -管狀型中的表達,兩者差異具有統計學意義;P2Y2受體在Ⅲ ～Ⅳ期中的表達量明顯高于Ⅰ ～Ⅱ期中的表達,兩者差異具有統計學意義。因此表明,P2Y2受體的表達與 SACC的惡性程度有關,SACC的惡性程度越高,P2Y2受體的表達量越高,SACC中P2Y2受體表達的高低與腫瘤的惡性程度呈正相關性。但對于 P2Y2受體的活化是否與腺樣囊性癌細胞的侵襲和轉移相關,以及 MAPK通路是否在此過程中起到重要作用,還有待于進一步的研究。

本實驗結果顯示,P2Y2受體在 SACC中主要分布在未分化的,體積較小的基底樣腫瘤細胞(即分化較差的腫瘤細胞)和導管樣腫瘤細胞中,肌上皮樣腫瘤細胞中幾乎無表達。從分化的角度分析,腫瘤細胞是在分化過程中停止下來的未分化完全的細胞,是分化阻斷和分化缺陷的細胞,腫瘤可以被看作為一種分化異常的疾病[11]。腫瘤細胞的本質與正在分化過程中的正常細胞有著一定的相似性,雖然與正常細胞相比較,其分化特征逐漸消失,但仍具備不同程度的分化潛能。所以,癌變后的細胞仍保留一定的分化潛能,具有不同程度的“自發性”分化表現。超微結構和免疫組化證實,SACC由體積較小的未分化細胞,立方形閏管細胞,腺樣分泌細胞和梭形肌上皮細胞組成,這幾種細胞雖然都是腫瘤細胞,但具有不同的分化程度,其中,肌上皮樣細胞是分化較為良好的腫瘤細胞。本次實驗結果表明,P2Y2受體的表達可能與 SACC細胞的分化具有相關性。

3.4 P2Y2受體與 SACC神經侵襲的關系

本次實驗結果顯示,P2Y2受體在神經侵襲型SACC中的表達高于在非神經侵襲型中的表達,兩者差別具有統計學意義。分析這一結果,可能有兩種原因：①神經受到損傷后,神經纖維束中 P2Y2受體的表達量增加;②P2Y2受體的表達與 SACC細胞的侵襲能力有關,在侵襲能力較強的腫瘤細胞中呈現高表達。

嗜神經生長是腺樣囊性癌較為顯著的生物學特性之一。近年來,有研究證明[12],神經生長因子在SACC中的表達可能與其具有相關性。神經生長因子的表達是維持涎腺組織正常表型的重要標志,當其惡變為 ACC腫瘤時,ACC腫瘤中肌上皮樣腫瘤細胞向雪旺氏樣細胞樣表型分化,而雪旺氏細胞具有包繞神經生長的特性,腫瘤與神經接觸后,通過它們之間的相互作用,進一步使腫瘤表現出雪旺氏細胞的特性,并出現了神經生長因子表達的變化。有關研究證實,在雪旺氏細胞表面具有 P2Y受體的一些亞型分布,主要是 P2Y4和 P2Y6,它們具有調節雪旺細胞內 cAMP水平的功能[13]。可見,P2Y受體的表達可能與 SACC神經侵襲生長的生物學特性有關。已知神經細胞損傷后向胞外釋放 ATP,當腫瘤與神經接觸后,ATP與 P2Y受體的相互作用是否會影響到 SACC腫瘤細胞的侵襲能力,還有待于進一步的研究。

ATP作為一種傳統補充能量物質,已在臨床應用多年,具有價格低廉,毒副作用少,安全性高等特點。目前,關于嘌呤受體活化與腫瘤進展關系的研究較少,本課題的完成可為尋找具有新的作用機制的抗癌藥物開辟新的研究領域,為進一步探討涎腺腫瘤基因治療奠定基礎,對于提高腺樣囊性癌的治療水平有重要指導意義。

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Expression o f P2Y2purinocep tor in hum an salivary gland and adenoid cystic carcinom a

GAO Lu1,CHAISong-ling1,ZHANG Fu-yin2
(1.Department of Stomatology,Dalian Medical University,Dalian 116044,China;2.Department of Stomatology,the First Affiliated Hospital of Da lian Medical University,Da lian 116044,China)

[Objective]To study and investigated the clinical significance of P2Y2in salivary adenoid cystic carcinoma(SACC).[Methods]The expression and distribution of P2Y2in 49 SACC and their surrounding salivary tissues were examined with immunohistochemistry,then the gray-scale degreeof P2Y2wasmeasured bym icroscopic analyzing technique.[Results]The average gray scaleof P2Y2in the 49SACC specimens being 12.73±7.59was significantly higher than that of surrounding salivary tissues being 3.76±1.82(P＜0.05).In the SACC,the average scales of P2Y2in the solid type,Ⅲ ～Ⅳ stage and nerve invaded groupswere significantly higher than those in theadenoid-tubular type,Ⅰ ～Ⅱ stage and non-nerve invaded groups,respectively(P＜0.05).[Conclusion]Theexpression of P2Y2is positively correlated tomalignancy of SACC.

salivary adenoid cystic carcinoma;purinoceptor P2Y2;ATP;immunohistochem istry

R 730.2

A

1671-7295(2011)01-0017-06

2010-11-01;

2010-12-08

高 璐(1978-),女,遼寧大連人,講師,碩士。 E-mail：dygaolu@sina.com

張福胤,教授。E-mail：zhangfuyin@yahoo.com.cn