肝癌干細胞的分子標記與靶向治療

陳怡，邵榮光

腫瘤干細胞假說認為只有很小一部分細胞具有引起腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、保持腫瘤異質(zhì)性的能力，這樣的細胞叫腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）。腫瘤干細胞假說認為腫瘤組織與正常組織一樣，是由處于各種分化等級的細胞組成的。其中，有一種在數(shù)量上占少數(shù)的干細胞樣細胞，它具有無限的增殖能力和分化潛能，是腫瘤形成的起始細胞。它在腫瘤的發(fā)生、惡化、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中起重要作用。目前已經(jīng)成功的在白血病、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌等實體腫瘤中鑒定分離到腫瘤干細胞的存在[1-5]。本文就近幾年肝癌干細胞的表面分子標記、分離及成瘤性，以及針對肝癌干細胞的靶向治療進行了綜述。

1 肝癌干細胞的表面分子標記

目前，運用細胞表面分子標記分選的方法獲到 CSC 得到廣泛的應(yīng)用，而這些表面分子標記是某些 CSC 的特征標記之一，但它又在正常干細胞甚至上皮細胞廣泛表達，所以尋找更好的分子標記成為當務(wù)之急。

1.1 CD133

CD133 為5 次跨膜糖蛋白，CD133 蛋白在神經(jīng)干細胞、表皮干細胞、內(nèi)皮祖細胞等多種干/祖細胞中都有表達。近年的研究發(fā)現(xiàn)，CD133 在白血病干細胞以及腦腫瘤干細胞、大腸癌干細胞、前列腺癌干細胞等多種實體腫瘤干細胞中均有表達[6-7]。Suetsugu 等[8]用 CD133 鑒定肝癌干細胞，體外實驗發(fā)現(xiàn)相對 CD133– 細胞，CD133+ 細胞有著更高的增殖潛能，且成熟肝細胞標志物 mRNA 的水平較低，而肝癌早期標志物 AFP 的 mRNA 水平明顯高于對照組。Ma等[9]用多種已確定的干細胞特異標記物來分選純化肝癌組織，最終鑒定和分選出了一小部分 CD133 陽性表達的具有干細胞特性的肝癌細胞，CD133+ 細胞具有更強的克隆形成能力、增殖能力和成瘤性。這群細胞具有與前體細胞相似的特性，包括表達干性基因，自我更新能力和非肝細胞系分化的能力。在此基礎(chǔ)上，Ma 等[10]運用雙向電泳，比較了CD133+ 和 CD133– 亞型蛋白表達，發(fā)現(xiàn) ALDH 與CD133 的表達成正相關(guān)，發(fā)現(xiàn) CD133+ALDH+ 細胞具有更顯著的成瘤性。Yin 等[11]發(fā)現(xiàn) CD133+ 細胞存在于人肝癌細胞株和原位肝癌組織中，CD133+ 細胞具有更強的成瘤性和克隆形成能力。Yoshikawa 等[12]發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞和膽管癌細胞中都有 CD133 的表達，分離出來的 CD133+ 和CD133– 在連續(xù)培養(yǎng)中能同樣產(chǎn)生 CD133+ 和 CD133–細胞。

1.2 EpCAM

EpCAM 是高致瘤性腫瘤細胞的一個標記。Yamashita等[13]發(fā)現(xiàn)在肝癌活檢標本中，EpCAM+ AFP+ 亞型細胞在基因表達和信號通路分析中具有肝癌干細胞/前體細胞的特性。而從肝癌細胞中分離的 EpCAM+ 細胞具有腫瘤干細胞特性，具有自我更新能力和分化能力，并在體內(nèi)有更強的侵襲能力。Kimura 等[14]發(fā)現(xiàn)肝癌 EpCAM+ 亞群具有更強的克隆形成率，然而細胞增殖沒有差別。體內(nèi)致瘤實驗，運用了超免疫缺陷 NOD/SCID/γcnull（NOG）鼠，發(fā)現(xiàn)最少 100 個EpCAM+ 細胞能形成腫瘤，而 EpCAM- 細胞不能成瘤。不論在體外還是體內(nèi)，EpCAM+ 細胞能交叉分化出EpCAM+ 和 EpCAM– 細胞，而 EpCAM– 細胞保持其表型。有趣的是，導(dǎo)入外源性的 EpCAM 到兩群細胞中，盡管 EpCAM 表達量一致，卻只能顯著增加 EpCAM+ 克隆的成瘤性，而對 EpCAM– 克隆沒有影響。

1.3 CD90

Yang 等[15]從 6 種肝癌細胞株中分離 CD90+ 和CD90– 的細胞，發(fā)現(xiàn) CD90+ 細胞顯示出成瘤的能力，更容易形成裸鼠肺轉(zhuǎn)移病灶，而非 CD90– 的細胞。還發(fā)現(xiàn)在肝癌腫瘤標本和肝癌患者的血液樣本中，都有較高比例的CD45– CD90+ 細胞。從移植瘤內(nèi)分離到的 CD90+ 細胞可在免疫缺陷小鼠體內(nèi)二次成瘤及三次成瘤。

1.4 其他表面標記

Yang 等[16]用肝前體細胞（卵圓細胞）標志 OV6 從肝癌細胞株及原位癌組織中分離出了 OV6+ 細胞，該細胞亞群具有 Wnt/β-catenin 通路內(nèi)源性活化。OV6+ 細胞與OV6– 細胞比較表現(xiàn)出更強的體內(nèi)成瘤性和對常規(guī)化療的耐藥。周思朗等[17]用二乙基亞硝胺誘導(dǎo)大鼠肝癌，分離培養(yǎng)腫瘤細胞，按照卵圓細胞表面標記（CD34、c2Kit，Thy21、AFP、CK7、CK8、CK14、CK18、CK19 和 GGT）分選腫瘤細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CD34、Thy21、CK7、CK8、AFP 和 GGT等 6 個標記的陽性與陰性腫瘤細胞移植裸鼠后，成瘤能力差異顯著（P＜0.05 或 0.01）；1/100～1/10 細胞密度的CK7 陰性與 AFP 陽性細胞亞群成瘤能力仍然比其對應(yīng)細胞亞群為高，CK7（–）和 AFP（+）可能是大鼠肝癌干細胞的部分表面標記特征。

2 肝癌干細胞的分離及成瘤性

目前，CSC 的分離主要通過三種途徑：側(cè)群細胞法、表面分子標記以及成球培養(yǎng)。下面介紹近幾年肝癌干細胞分離和成瘤性的研究進展。

2.1 側(cè)群細胞

側(cè)群細胞（side population，SP）是一群由于具有 ABC膜轉(zhuǎn)運蛋白而能夠?qū)?DNA 染料 Hoechst 33342 或羅丹明123 外排的細胞，利用流式細胞儀可以將這群細胞檢測出來。眾多實驗提示 SP 細胞可能是干細胞或前體細胞的篩選標志。2006年，Chiba 等[18]首次通過 SP 細胞分選得到肝癌干細胞，發(fā)現(xiàn) SP 細胞與非 SP 細胞相比，具有更強的增殖能力，凋亡細胞較少，表達肝細胞、膽管細胞和胚胎肝細胞標志物，具有更強的腫瘤形成能力。SP 細胞在體內(nèi)外能通過不對稱分裂產(chǎn)生 SP 細胞和非 SP 細胞，基因芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn) SP 細胞表達一些干細胞基因，研究表明肝癌 SP細胞具有腫瘤干細胞特性。Kamohara 等[19]分離了 Huh7 細胞中的 SP 細胞，按照細胞周期分離了 G0 期細胞，發(fā)現(xiàn)G0 期細胞具有較高的成球性，并在 NOD/SCID 鼠體內(nèi)有顯著的成瘤性，并且表達肝細胞和膽管細胞分化的標志，表明此細胞亞群具有自我更新、致瘤性和雙向分化的特性。目前，SP 細胞法來進行 CSC 的分選可以成功富集得到CSC，但是因為許多 CSC 具有 ABC 轉(zhuǎn)運蛋白以外的逃避藥物治療的機制，這種機制不能單靠采用 Hoechst 染料的方法來鑒定；SP 細胞可能遭受染料的毒性作用而喪失了潛在的干細胞特性，SP 細胞不一定包含所有的 CSC。

2.2 運用多個細胞表面分子標記相結(jié)合

除了運用單一細胞表面分子標記，近年來很多研究發(fā)現(xiàn)，只有運用兩個或者兩個以上的 CSC 細胞表面分子標記才能更好地分離 CSC。研究發(fā)現(xiàn)，CD133+ 細胞中CD133+CD44+ 亞型是體內(nèi)形成腫瘤的主要亞型，而非CD133+CD44– 亞型，這類 CD133和 CD44 雙陽性的細胞更多地表達干細胞相關(guān)基因和更加耐藥，這種耐藥與高表達人腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體（ABC）蛋白相關(guān)[20]。CD90[15]是一個肝癌干細胞的表面分子標記，進一步研究發(fā)現(xiàn)，其中CD90+CD44+ 亞群比 CD90+CD44– 亞群細胞更具有侵襲性，可在免疫缺陷小鼠的肝臟原位成瘤并形成肺轉(zhuǎn)移瘤。

2.3 細胞成球

細胞成球?qū)嶒炇钱斍拌b定 CSC 的方法之一，過程是原腫瘤細胞經(jīng)過消化成單細胞后，在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到形成克隆球（腫瘤球），隨后進一步證實腫瘤球在傳代過程中具有自我更新能力。但腫瘤球仍然是個混合細胞群體，它僅代表一小部分腫瘤起源細胞，有研究表明成球的肝癌細胞有高表達 CD133 肝癌干細胞表面分子標記[21]。目前除了神經(jīng)球培養(yǎng)條件較為成熟，其他腫瘤干細胞成球培養(yǎng)的條件也是不太一致，限制了這種方法的應(yīng)用。

3 肝癌腫瘤干細胞的靶向治療

3.1 分子靶向治療

針對 CSC 特異的表面分子標志有望成為一條分子靶向治療的途徑。Yao 等[22]運用 CD133 的反義核苷酸敲除了CD133 的表達，抑制了膠質(zhì)瘤細胞的增殖，降低了肝癌細胞克隆形成能力，改變了周期分布。這說明 CD133 在這些腫瘤細胞生長過程中起了重要的作用，而 prominin-2，CD133/prominin-1 同源蛋白不具有相同功能。

另外，抑制腫瘤干細胞特異通路將成為治療腫瘤的一條有效途徑。Ma 等[23]證明活化的 Akt/ PKB 和 Bcl-2 通路在 CD133+ 腫瘤細胞耐藥中起主要作用，運用 Akt1 的抑制劑能增加 CD133+ 腫瘤細胞對常規(guī)化療藥物 5-FU 的敏感性。肝癌細胞和具有致瘤性肝前體細胞在缺氧情況下細胞活性增加，HIF-1α 和 Akt 上調(diào)，形成 PDGF-BB、Akt/HIF-1α/PDGF-BB 通路組成的自分泌信號環(huán)路，引起了細胞對順鉑的耐藥。在原位肝癌模型中，加入 HIF-1α 的抑制劑 YC1 后，阻斷了缺血性缺氧時 HIF-1α 的活化，顯著增強了化療的效果，導(dǎo)致了腫瘤生長的抑制，延長了動物的生存期。提示 Akt/HIF-1α/PDGF-BB 環(huán)行通路作為靶點，有望成為致瘤性的肝前體細胞及肝癌細胞的治療靶點，更有利于我們從肝癌起源上尋找有效藥物[24]。

肝癌細胞有可能由 STAT3+、NANOG+、OCT3/4+ 的肝前體/干細胞轉(zhuǎn)化而來，伴隨有 TGF-β 失活，Lin 等[25]在 TGF-β 失活的肝癌細胞中，運用 NSC74859（一種STAT3 的特異抑制劑）能顯著地抑制腫瘤的生長，雖然CD133+ 和 CD133– 細胞均對 NSC74859 敏感，IC50 為100 μmol/L，但該抑制劑能顯著阻滯體內(nèi)腫瘤的生長，因此，IL6/STAT3 有望成為更好的肝癌治療靶點。

在 Wnt/β-catenin 通路內(nèi)源性活化的 OV6+ 肝腫瘤干細胞中，運用慢病毒攜帶的穩(wěn)定表達的 micro-RNA 抑制β-catenin 通路活性，能顯著減少 OV6+ 細胞的數(shù)量，并且逆轉(zhuǎn) OV6+ 細胞的耐藥[16]。活化 Wnt/β-catenin 通路能增加 EpCAM+ 細胞的數(shù)量，而用 RNAi 阻斷 Wnt/β-catenin通路的靶點 EpCAM 后能降低 EpCAM+ 細胞的活性[12]。

You 等[26]發(fā)現(xiàn) TGFβ1 調(diào)節(jié)肝癌細胞中 CD133 表達具有時間和劑量依賴性。TGFβ1 誘導(dǎo)的 CD133 + Hhu7 細胞后，增加了細胞體內(nèi)形成腫瘤的能力。運用 Smads 抑制劑，減弱了 TGFβ1 誘導(dǎo)的 CD133+ 的表達。在 CD133–的 Hhu7 細胞中，TGFβ1 的刺激抑制了 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的表達，運用 Smads 抑制劑能部分恢復(fù) DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。提示 TGFβ1 能通過抑制 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)節(jié)CD133 的表達，TGFβ1 誘導(dǎo)的 CD133+ 的表達依賴Smads 通路。

BMI1 在間充質(zhì)干細胞自我更新中起著重要作用，肝癌中 SP 細胞比非 SP 細胞優(yōu)先表達 BMI1，慢病毒敲除BMI1 能持續(xù)減少 Huh7 和 PLC/PRF/5 肝癌細胞中的 SP細胞數(shù)，更重要的是敲除 BMI1 消除了 SP 細胞體內(nèi)誘發(fā)腫瘤的作用，去除對 BMI1 主要靶基因 INK4A 和 ARF的阻斷，也不能修復(fù) SP 細胞的自我更新能力[27]。

3.2 促分化治療

我們推測 CSC 的分化將最終抑制致癌作用，因為CSC 的致瘤性很大程度上是由其自我更新能力決定的。促分化治療在白血病中取得了很好的效果，那么通過促進CSC 分化在肝癌中的作用尚處于起步階段。肝細胞核因子（HNF）4a 是肝生成中一個必須的中心轉(zhuǎn)錄因子。運用重組腺病毒基因傳遞系統(tǒng)，將 HNF4a 導(dǎo)入 Hep3B 和HepG2 肝癌細胞，發(fā)現(xiàn) HNF4a 能誘導(dǎo)肝癌細胞分化成肝細胞，能顯著地降低干細胞基因的表達，能減少 CD133+ 和CD90+ 細胞的比例。然而，HNF4a 降低 Hep3B 細胞活性是通過誘導(dǎo)凋亡，而對 HepG2 則是引起周期阻滯和細胞衰老。導(dǎo)入 HNF4a 也能降低肝癌細胞成瘤性[28]。

3.3 抗體治療

單克隆抗體被認為是重要的腫瘤治療的方式。應(yīng)用CD44 抗體阻斷 CD44 活性，可誘導(dǎo) CD90+ 細胞體外凋亡，并抑制 CD90+ 細胞在免疫缺陷小鼠體內(nèi)成瘤。以上實驗結(jié)果提示，CD90 是一個較理想的肝癌干細胞候選標志物，而 CD44 是針對 CD90+ 肝癌干細胞的潛在治療靶點[14]。孫力超等[29]分離獲得人原位肝癌組織中 CSC，采用獨特的技術(shù)制備了大容量功能性單抗庫，通過對 2964 個雜交瘤克隆的篩選，獲得了 116株能與人肝癌干細胞樣細胞膜結(jié)合的陽性單抗。其中有 33株能識別 SP 分選的 CSC，6株還能識別 CD133+ CSC 和含高比例 CSC 的成球細胞。裸鼠體內(nèi)致瘤性研究發(fā)現(xiàn)，其中 4株單抗分選的陽性細胞的致瘤性較單抗陰性細胞高 100 倍，證明了這 4株單抗是抗肝癌 CSC 的單抗。此外，體外功能研究還證明，這些單抗能顯著抑制 SP 分選的 CSC 和成球 CSC 的增殖與成球生長。

除了針對 CSC 本身的抗體靶向治療以外，針對其局部生存環(huán)境的靶向治療也有望成為一個有效的靶點。其中VEGF 及其受體作為血管內(nèi)皮血管床的主要成分參與 CSC小生境的構(gòu)成，但其在靶向治療 CSC 中的作用有待進一步研究。

4 展望

目前限制肝癌干細胞研究的問題主要集中在以下幾個方面：①表面分子標記的特異性差：目前肝癌干細胞的表面分子標記比較雜亂，不同實驗室、不同的細胞株、不同來源的臨床標本差異性較大，如何結(jié)合兩個或兩個以上的標志也值得思考和實驗驗證；②動物模型：目前腫瘤干細胞運用的多為NOD/SCID 小鼠，但有文獻在裸鼠或者免疫更缺陷的NOG 鼠體內(nèi)驗證腫瘤干細胞的成瘤性。研究發(fā)現(xiàn)同一個細胞株，相同的分子標記，在同一個實驗中，NOD/SCID 小鼠中僅需要比裸鼠更少的細胞就能成瘤，如何選擇合適的動物，需要進一步研究。

靶向肝癌干細胞的治療將有望給肝癌的治療帶來新的契機，一方面尋找更特異性的表面分子標志顯得尤為重要，另一個方面單一靶點治療顯得有限，需要從不同的信號通路上尋找多靶點的藥物，針對肝癌干細胞本身和針對肝癌干細胞小生境的治療相結(jié)合也將更加有效抑制肝癌的生長和轉(zhuǎn)移。

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