脂肪干細胞應用于脂肪移植的新進展

羅旋 綜述 王琳 范志宏 審校

脂肪干細胞應用于脂肪移植的新進展

羅旋 綜述 王琳 范志宏 審校

脂肪干細胞（Adipose derived stem cells，ADSC）具有多向分化和自我復制能力，逐漸成為損傷修復及再生醫學研究的熱點。ADSC能夠分化為脂肪細胞以及血管內皮細胞，可分泌細胞因子，促進血管新生，改善炎癥損傷的微環境，并抑制細胞凋亡。在脂肪移植中應用脂肪干細胞，可以明顯降低移植后脂肪組織的液化吸收，減少不良反應發生率，提高遠期療效。

脂肪干細胞脂肪移植血管新生微環境

自體脂肪組織作為軟組織填充物不發生免疫排斥反應，并且質地自然、獲取容易，然而脂肪細胞液化吸收、組織纖維囊形成等問題一直未能解決。以往的研究主要采用優化手術操作技巧、增加漂洗、低溫保護等措施，以降低脂肪組織的損傷，但沒能從根本上解決移植物損傷嚴重、存活困難的問題。脂肪干細胞的引入，給脂肪移植后的組織存活帶來革命性的改進。由于具有自我復制能力和多向分化潛能，能分泌多種細胞因子和生長因子，脂肪干細胞添加到移植物中，大大提高了脂肪細胞移植后的存活率，降低了壞死、液化、纖維化、鈣化等不良反應的發生率。

吸脂術的出現使大量脂肪組織的獲得成為可能，然而負壓吸引和機械損傷使成熟脂肪細胞破裂和壞死明顯增加，并且抽吸出的脂肪組織相比切取的脂肪組織，缺少了結締組織、血管等成份，其脂肪干細胞的獲得量是切取脂肪組織獲得量的一半[1]。大量脂肪干細胞留在供區，只有少數脂肪干細胞隨成熟脂肪細胞團塊被注射到受區。Matsumoto等把同一供者來源的脂肪抽吸物與切取的完整脂肪組織相比較，抽吸物中的脂肪干細胞數較切取的脂肪組織中少（48±13）%。另有學者將添加了脂肪干細胞的顆粒脂肪和單純顆粒脂肪，分別注射到免疫缺陷小鼠皮下，4周后，添加脂肪干細胞組的移植物體積比單純顆粒脂肪移植組平均高35%，且移植后組織中血管密度顯著增加[2]?；谝陨辖Y果可知，吸脂術中得來的脂肪因缺乏完整脂肪組織中的干細胞及基質成分，難以在移植后長期存活。Yoshimura等利用富含脂肪干細胞的基質血管成份（Stromal vascular fraction，SVF）添加到移植的脂肪組織中，提高了移植物中干細胞的比例，稱為細胞輔助的脂肪移植（Cell assisted lipo-transfer，CAL）。在自體脂肪移植隆乳術中，初始注射脂肪體積平均270 mL，兩個月時為100～200 mL；40名受試者中除4人出現纖維囊或鈣化形成，絕大多數人對手術結果很滿意[3]。該結果揭示了脂肪干細胞在顆粒脂肪移植中的應用前景。

1 脂肪干細胞的表型特征

目前，脂肪干細胞的分離、富集多是采取膠原酶消化皮下脂肪，獲得一個混雜的細胞群體——SVF，再利用細胞表面分子分選，或通過體外培養傳代，獲得較純的脂肪干細胞[4]。因此，對細胞的表型分析可用于脂肪干細胞的純化和鑒定。

目前還沒有一個單一的分子能夠作為脂肪干細胞的特異性表型，公認的脂肪干細胞表面表達量較高的分子有：基質相關標志（CD29、CD44），間充質標志（CD73、CD90）等[5]，而SVF中混雜的其他細胞標志，如血管內皮細胞（CD31）、管壁細胞（CD140）、單核細胞（CD14）、巨噬細胞（CD11）、造血細胞（CD45）、紅細胞（Ter119）、淋巴細胞（CD3、CD4、CD8、CD19）等均呈陰性表達[6-10]。

分離的原代脂肪干細胞，經體外培養傳代3次后，表型會有所變化。CD34是一種黏附分子，在介導細胞間黏附時發揮重要作用，還參與造血干細胞的運輸、定植，參與炎癥反應及淋巴細胞的歸巢，被認為是干細胞和祖細胞多向分化潛能的標志之一。在未經體外培養的脂肪干細胞表面高表達，傳代3次后表達消失，然而CD34的表達與否對脂肪干細胞的分化活性沒有影響[9-14]。CD105是一種內皮糖蛋白，也被視為多向分化潛能的標志，其表達隨著體外培養傳代次數的增加而逐漸上調[15]。

另外，脂肪干細胞表面還發現了一些分子，雖不像上述分子表達量高，但反映了脂肪干細胞的間充質來源和其在組織中基質血管旁的定位。這些分子包括：間充質標志（CD10、CD13）[5，11]，細胞間黏附分子（CD54），血管細胞黏附分子（CD59、CD146）[6]，白細胞活化黏附因子（纖連蛋白、內皮粘液素、平滑肌特異性α肌動蛋白、鈣調蛋白、鈣結合蛋白、波形蛋白等[16]）。極少數（＜10%）脂肪干細胞表達STRO-1[10]。

2 脂肪干細胞在脂肪游離移植中的作用。

2.1 脂肪干細胞分化為脂肪細胞，維持移植物的體積

脂肪干細胞分化為體積較大的成熟脂肪細胞，補充移植過程中損傷壞死的脂肪細胞，是維持移植物體積、保證移植后長期療效的關鍵。應用激素、細胞因子等誘導脂肪干細胞向脂肪細胞分化已經實現。在脂肪干細胞中，CD24+的細胞被證明有較高的成脂分化能力[8]；體內試驗中，脂肪干細胞復合海綿狀膠原能在裸鼠體內，經8周時間形成脂肪樣組織[17]。向脂肪細胞分化的脂肪干細胞表達脂蛋白脂肪酶、轉錄因子aP2、過氧化物酶體增殖激活性受體-γ（Peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ）和葡萄糖轉運蛋白4（Glucose transporter protein 4，Glut4）等脂肪細胞相關基因[18]。其他影響內環境的因素，如內外源性的生長因子、氧分壓、pH值、細胞外基質中的黏附分子、相鄰細胞的作用、生物力學因素等，都會作用于細胞，使之增殖或改變其分化能力?？梢源_定能促進脂肪干細胞成脂分化的因素有：糖皮質激素、生長激素、胰島素、前列腺素、甲狀腺激素、胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)等，而表皮生長因子（epithelial growth factor，EGF）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）則抑制成脂分化。

2.2 脂肪干細胞促進血管結構的生成，增加移植物血供

成熟的脂肪細胞對缺血、缺氧很敏感，在氧分壓較低的環境中很容易發生一系列應激性改變，如吐出胞質中的脂滴、細胞體積逐漸縮小；并且當氧分壓低于所能耐受的閾值?時，24 h內就會死亡。然而，移植后受區基底組織中的毛細血管長入需要7 d時間[19]，因此盡早建立血供才能減少移植后組織細胞凋亡，維持移植物的體積[20]。

脂肪組織生長時，血管生成也很活躍，且是最先開始的，抑制血管生成將會導致脂肪組織萎縮[9]。脂肪干細胞參與血管構建過程，已被多次證實[9，11，21-23]：Borges等將人的脂肪干細胞和血管內皮細胞共同移植，能有效構建雞的絨毛尿囊膜的微血管網絡，肯定了脂肪干細胞促進血管生成的作用[20]；添加了成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，FGF）的脂肪干細胞注入鼠缺血后肢肌肉間隙，能使之耐受缺氧并保護周邊的細胞，使其在缺氧環境中減少損傷，明顯提高毛細血管血液灌流和缺血肌肉的存活率；還有研究表明，在隨意皮瓣缺血損傷動物模型中，脂肪干細胞的注入可以使皮瓣毛細血管密度增加，血液灌流增加，成活率提高[9，24]；Ebrahimian等[25]的皮膚創傷修復研究中，脂肪干細胞的應用提高了創傷后皮膚血液灌流以及毛細血管密度。

2.2.1 脂肪干細胞分化為血管內皮細胞，形成血管結構

Amos等[26]的實驗表明，未分化的脂肪干細胞不表達任何內皮細胞表面標志，接種于基質上培養會呈現類似血管內皮細胞形態的多角形。在內皮細胞生長添加劑（Endothelial cell growth supplement，ECGS）和生物剪切力的協同作用下，脂肪干細胞重新排列，攝取乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL），表達血管內皮細胞表面標志CD31和血管干細胞相關分子，如血小板源性生長因子（Platelet derived growth factor-BB，PDGFBB）、血管內皮生長因子165（Vascular endothelial growth factor-165，VEGF-165）；還表達周細胞表面標志，如平滑肌α肌動蛋白、神經膠質細胞抗原2。雖然未能檢測到表達一氧化氮合成酶（Nitric oxide synthase，eNOS）、血管假性血友病因子（Von Willebrand factor，vWF）[25，27]，但足以說明脂肪干細胞經過一定的環境誘導可以向內皮細胞分化。

2.2.2 脂肪干細胞通過旁分泌作用促進血管新生

大多數脂肪干細胞注入受區后定位于毛細血管周圍，而不是參與其構成；脂肪干細胞和血管內皮細胞共培養時可見脂肪干細胞聚集在血管周圍，緊貼血管壁，同時血管伸出新芽，聯結成網絡結構的能力明顯增強[5]；脂肪干細胞的條件培養液使體外培養的毛細血管內皮細胞存活率從50%提高到100%。以上現象提示，未分化的脂肪干細胞在促進血管新生和穩定血管結構的過程中，主要以旁分泌形式發揮作用[12，28-29]。脂肪干細胞本身就能較高水平地分泌血管內皮細胞生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor，HGF）、轉化生長因子-β（Transforming growth factor-β，TGF-β），少量分泌粒細胞-巨噬細胞集落細胞刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）、堿性成纖維細胞生長因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF）等促進血管生成、抗凋亡的生長因子。在缺氧的環境中，脂肪干細胞被激活而分泌更多的VEGF[9]，發揮抗缺血、抗炎修復功能。脂肪干細胞還可以分泌胰島素樣生長因子-1（Insulin like growth factor-1，IGF-1）[30]，除能抑制細胞凋亡[5]，還有動員內皮祖細胞（Endothelial progenitor cells，EPCs）等作用[31]，促進血管生成。脂肪干細胞分泌的其他活性因子也具有抗炎修復能力，包括炎癥因子：IL-6、IL-8、IL-11、IL-17；細胞趨化因子：單核細胞趨化蛋白1和2、巨噬細胞集落刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor，MCSF）等[5]，對血管生成起著輔助的協同作用。

2.3 脂肪干細胞調節受損組織局部微環境

脂肪細胞在移植到受區后幾個月內就會死亡，由新生的脂肪細胞取代，所以建立有利于組織生存的微環境對于移植后的修復和重建至關重要。脂肪干細胞可以分泌一系列細胞因子和生長因子到周圍組織液中，調節組織微環境，形成有利于干細胞生長的微環境——“干細胞巢”，招募來自于受體的內源性干細胞到達靶點，并使其向所需要的特定組織細胞定向分化。脂肪干細胞本身能夠耐受缺氧，同時在缺氧的環境中還能釋放抗氧化物質、自由基清除劑、分子伴侶、熱休克蛋白等，清除受損局部的細胞毒性物質，促進尚存活的細胞復蘇，在脂肪移植后形成有利于組織細胞存活和功能維持的微環境[4]。

3 脂肪干細胞應用于顆粒脂肪移植技術中的發展及展望

在顆粒脂肪移植技術中添加脂肪干細胞，能夠明顯減少脂肪液化吸收，改善長期效果。首先，脂肪干細胞能夠分化為脂肪細胞，補充因損傷而減少的脂肪細胞數量；其次，脂肪干細胞分化為血管內皮細胞，通過旁分泌促進血管新生，促進血供恢復；此外，脂肪干細胞通過旁分泌作用，調整組織局部微環境，減少細胞損傷，提高移植后組織細胞存活率，使得脂肪游離移植的長期效果更穩定。

雖然已有早期的臨床實驗初步證明，在顆粒脂肪移植中添加脂肪干細胞可以有效提高成活率，改善不良反應，提高長期效果[3]。然而，移植物中干細胞與脂肪組織的最佳比例及脂肪細胞與脂肪干細胞之間的相互作用和轉歸等，還有待進一步研究。

相比SVF，傳代培養的脂肪干細胞抗原性減弱，當與異體外周單核細胞共培養時，不會刺激混合淋巴細胞反應，提示脂肪干細胞在體內不會引起細胞毒T細胞反應[13，32-33]，即脂肪干細胞有一定的免疫抑制能力，然而脂肪干細胞在臨床實踐中是否能夠用于同種異體移植，以及長期應用是否具有成瘤性等安全問題，還有待更多更深入的研究來進一步驗證[4]。

在機體生長發育到衰老過程中，干細胞的數目逐漸減少，多向分化的活性逐漸減弱[34]，所以，如同建立臍帶血干細胞庫一樣，建立脂肪干細胞庫，及時將脂肪干細胞保存起來，可能是再生醫學今后發展的趨勢。

[1]Eto H,Suga H,Matsumoto D,et al.Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue [J].Plast Reconstr Surg,2009,124(4):1087-1097.

[2]Matsumoto D,Sato K,Gonda K,et al.Cell-assisted lipotransfer: supportive use of human adipose-derived cells for soft tissue augmentation with lipoinjection[J].Tissue Eng,2006,12(12): 3375-3382.

[3]Yoshimura K,Sato K,Aoi N,et al.Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation:supportive use of adipose-derived stem/stromal cells[J].Aesthetic Plast Surg,2008,32(1):48-55.

[4]Gimble JM,Katz AJ,Bunnell BA.Adipose-derived stem cells for regenerative medicine[J].Circ Res,2007,100(9):1249-1260.

[5]Traktuev DO,Merfeld-Clauss S,Li J,et al.A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers,reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks[J].Circ Res,2008,102(1):77-85.

[6]Rigotti G,Marchi A,Galie M,et al.Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant:a healing process mediated by adipose-derived adult stem cells[J].Plast Reconstr Surg,2007, 119(5):1409-1422.

[7]Boquest AC,Shahdadfar A,Fronsdal K,et al.Brinchmann,Isolation and transcription profiling of purified uncultured human stromal stem cells:alteration of gene expression after in vitro cell culture [J].Mol Biol Cell,2005,16(3):1131-1141.

[8]Rodeheffer MS,Birsoy K,Friedman JM.Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo[J].Cell,2008,135(2):240-249.

[9]Rehman J,Traktuev D,Li J,et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J].Circulation, 2004,109(10):1292-1298.

[10]Yang YI,Kim HI,Choi MY,et al.Ex vivo organ culture of adipose tissue for in situ mobilization of adipose-derived stem cells and defining the stem cell niche[J].J Cell Physiol,2010,224(3):807-816.

[11]Hong SJ,Traktuev DO,March KL.Therapeutic potential of adiposederived stem cells in vascular growth and tissue repair[J].Curr Opin Organ Transplant,2010,15(1):86-91.

[12]Schaffler A,Buchler C.Concise review:adipose tissue-derived stromal cells--basic and clinical implications for novel cell-based therapies[J].Stem Cells,2007,25(4):818-827.

[13]McIntosh K,Zvonic S,Garrett S,et al.The immunogenicity of human adipose-derived cells:temporal changes in vitro[J].Stem Cells,2006,24(5):1246-1253.

[14]Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284 (5411):143-147.

[15]Yoshimura K,Suga H,Eto H.Adipose-derived stem/progenitor cells:roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation[J].Regen Med,2009,4(2):265-273.

[16]Sugii S,Kida Y,Kawamura T,et al.Human and mouse adiposederived cells support feeder-independent induction of pluripotent stem cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(8):3558-3563. [17]von Heimburg D,Zachariah S,Heschel I,et al.Human preadipocytes seeded on freeze-dried collagen scaffolds investigated in vitro and in vivo[J].Biomaterials,2001,22(5):429-438.

[18]Wickham MQ,Erickson GR,Gimble JM,et al.Multipotent stromal cells derived from the infrapatellar fat pad of the knee[J].Clin Orthop Relat Res,2003,412:196-212.

[19]Nishimura T,Hashimoto H,Nakanishi I,et al.Microvascular angiogenesis and apoptosis in the survival of free fat grafts[J]. Laryngoscope,2000,110(8):1333-1338.

[20]Borges J,Mueller MC,Padron NT,et al.Engineered adipose tissue supplied by functional microvessels[J].Tissue Eng,2003,9(6): 1263-1270.

[21]Kim Y,Kim H,Cho H,et al.Direct comparison of human mesenchymal stem cells derived from adipose tissues and bone marrow in mediating neovascularization in response to vascular ischemia[J].Cell PhysiolBiochem,2007,20(6):867-876.

[22]Moon MH,Kim SY,Kim YJ,et al.Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells improve postnatal neovascularization in a mouse model of hindlimb ischemia[J].Cell Physiol Biochem,2006, 17(5-6):279-290.

[23]Cho SW,Moon SH,Lee SH,et al.Improvement of postnatal neovascularization by human embryonic stem cell derived endotheliallike cell transplantation in a mouse model of hindlimb ischemia [J].Circulation,2007,116(21):2409-2419.

[24]Lu F,Mizuno H,Uysal CA,et al.Improved viability of random pattern skin flaps through the use of adipose-derived stem cells [J].Plast Reconstr Surg,2008,121(1):50-58.

[25]Ebrahimian TG,Pouzoulet F,Squiban C,et al.Cell therapy based on adipose tissue-derived stromal cells promotes physiological and pathological wound healing[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2009,29(4):503-510.

[26]Amos PJ,Shang H,Bailey AM,et al.IFATS collection:the role of human adipose-derived stromal cells in inflammatory microvascular remodeling and evidence of a perivascular phenotype[J].Stem Cells, 2008,26(10):2682-2690.

[27]Fischer LJ,McIlhenny S,Tulenko T,et al.Endothelial differentiation of adipose-derived stem cells:effects of endothelial cell growth supplement and shear force[J].J Surg Res,2009,152(1):157-166. [28]Bhang SH,Cho SW,Lim JM,et al.Locally delivered growth factor enhances the angiogenic efficacy of adipose-derived stromal cells transplanted to ischemic limbs[J].Stem Cells,2009,27(8):1976-1986.

[29]Uysal AC,Mizuno H,Tobita M,et al.The effect of adipose-derived stem cells on ischemia-reperfusion injury:immunohistochemical and ultrastructural evaluation[J].Plast Reconstr Surg,2009,124(3): 804-815.

[30]Zhu M,Zhou Z,Chen Y,et al.Supplementation of fat grafts with adipose-derived regenerative cells improves long-term graft retention [J].Ann Plast Surg,2010,64(2):222-228.

[31]Kondo K,Shintani S,Shibata R,et al.Implantation of adiposederived regenerative cells enhances ischemia-induced angiogenesis [J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2009,29(1):61-66.

[32]Puissant B,Barreau C,Bourin P,et al.Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells:comparison with bone marrow mesenchymal stem cells[J].Br J Haematol,2005,129 (1):118-129.

[33]Cui L,Yin S,Yang P,et al.Human adipose derived stem cells suppress lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2005,85(27):1890-1894.

[34]Moseley TA,Zhu M,Hedrick MH.Adipose-derived stem and progenitor cells as fillers in plastic and reconstructive surgery[J]. Plast Reconstr Surg,2006,118(3 Suppl):121S-128S.

Application of Adipose Derived Stem Cells in Autologous Fat Transplantation

Adipose derived stem cells;Autologous lipo-transfer;Angiogenesis;Microenvironment

R622+.9

B

1673－0364（2011）03－0171－04

LUO Xuan,WANG Lin,FAN Zhihong.
Department of Plastic Surgery,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200127,China. Corresponding author：FAN Zhihong(E-mail：renji_plastic@vip.163.com).

2011年2月3日，

2011年3月11日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2011.03.015

200127上海市上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院整形外科。

范志宏（E-mail：renji_plastic@vip.163.com）。

【Summary】Adipose derived stem cells(ADSC)is an ideal source for regenerative medicine and tissue engineering,owing to its multipotential differentiation and self-replicating ability.ADSC can differentiate into fat cells and vascular endothelial cells.It can secrete cell factors,promote angiogenesis,improve the environment of inflammatory lesions,and inhibit cell apoptosis.Application of ADSC in autologous lipo-transfer has the advantages:reduction of the liquefaction and absorption of adipose tissue after transplantation,minimal adverse reactions,and long-term outcomes.