磷酸肌酸對膿毒癥大鼠心肌能量代謝的影響

李瑋 肖雄箭 林建東

臨床上，不管是在成人、兒童或新生兒中，膿毒癥是導致死亡的常見因素，其復雜的發病過程和病理生理變化，可能和機體免疫、代謝失調、心血管系統功能紊亂有關[1-2]。在膿毒癥所致的難治性低血壓和多器官功能不全中，有10％～20％的患者存在嚴重的心肌功能障礙，其機制可能和心肌缺血、缺氧、炎癥介質釋放等有關。心功能障礙時心肌細胞的生理改變為能量供給之間的失衡，表現為以高能磷酸鹽含量減少為特征的能量不足。本研究應用盲腸穿孔法復制大鼠膿毒癥模型，通過觀察磷酸肌酸鈉對心肌細胞葡萄糖6-磷酸酶活性及心肌腺苷酸水平的影響，結合心肌超微結構改變，探討磷酸肌酸鈉對膿毒癥心功能障礙的治療作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備 健康SD大鼠30只（上海斯萊克實驗動物有限公司提供），體重200～250g，雌雄不限，隨機分為3組：（1）假手術組（A組，n=10），不進行盲腸結扎穿孔術,于假手術前1h腹腔注射1m l的生理鹽水；（2）膿毒癥組（B組，n=10），于盲腸結扎穿孔術前1h注射1m l的生理鹽水；（3）磷酸肌酸鈉組（C組，n=10），于盲腸結扎穿孔術前1h腹腔注射磷酸肌酸鈉100mg/kg（1m l）。

假手術組動物只開腹、關腹與復蘇，不結扎、不穿孔盲腸。盲腸結扎穿孔術（caecum ligation per foration，CLP）制備ALI動物模型參考文獻[3]，術畢立即皮下注射50m l/kg林格氏液抗休克。實驗結束后，剖開胸腔，暴露心臟，快速取兩塊心肌組織（各約1cm3和1mm3），用于檢測葡萄糖6-磷酸酶的活性及透射電鏡觀察。同時用液氮保存的鋁夾在心臟原位冰凍，取組織100m g，置于液氮中低溫保存，高效液相色譜法檢測腺苷酸水平。

1.2 葡萄糖6-磷酸酶活性的半定量檢測 取1cm3組織塊于2.5％戊二醛溶液與二甲砷酸緩沖液中固定3h，按要求制備切片待檢，用日產LUZEX-F分析儀鏡檢及半定量分析，根據細胞內茶褐色硫化鉛沉淀分布的總面積大小進行半定量檢測葡萄糖6-磷酸酶的活性。

1.3 ATP、ADP和AMP含量測定 高效液相色譜儀由美國Waters公司生產，ATP、ADP和AMP標準品由美國Sigma公司提供。預柱為Nova.pakC18，色譜柱為Nova-pakC 18（3.9mm×150mm），按要求專人正確操作。將ATP、ADP和AM P標準品分別配制成0.01mmol/L，0.02mmo1/L，0.0625mmol/L和0.125mmol/L的標準液，取20μl進樣，得出標準曲線。使標準品濃度與峰面積呈良好的線性關系。將樣品ATP、ADP和AMP獲得的峰面積與標準峰面積相比，計算出樣品ATP、ADP和AMP的含量。

1.4 心肌細胞透射電鏡檢查 取1mm3心肌組織塊常規固化，用醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，超薄切片，在日立Hu-12A型透射電鏡下觀察。

表1 各組大鼠心肌G-6-PD活性、ATP、ADP和AMP含量測定值±s，n=10）

表1 各組大鼠心肌G-6-PD活性、ATP、ADP和AMP含量測定值±s，n=10）

注：*與假手術組比較P＜0.01；△與膿毒癥組比較P＜0.01

組別 G-6-PD（％） ATP（μmol/g） ADP（μmol/g） AMP（μmol/g）假手術組（A組） 2.51±0.85 2.69±0.81 4.18±0.49 4.85±0.61膿毒癥組（B組） 1.24±1.42* 1.36±0.40* 2.23±0.35* 3.14±0.52*磷酸肌酸組（C組） 1.90±0.54△ 2.01±0.42△ 3.96±0.50△ 5.06±0.72△

2 結果

2.1 葡萄糖6-磷酸酶的組織化學檢測 膿毒癥組與假手術組比較，葡萄糖6-磷酸酶活性明顯降低，而經磷酸肌酸處理后則明顯升高（P＜0.01）,見表1。

2.2 心肌ATP、ADP和AM P含量測定 膿毒癥組的心肌ATP、ADP和AMP含量明顯低于假手術組（P均＜0.01），經磷酸肌酸處理后含量明顯升高（P均＜0.01），見表1。

2.3 心肌細胞透射電鏡檢查 電鏡下見假手術組心肌細胞結構正常，線粒體無腫脹，嵴排列整齊，心肌纖維排列規則。膿毒癥組線粒體減少，腫脹變形，外膜不清，空泡化，核糖體脫顆粒，嵴減少或消失，排列紊亂。肌絲、股節結構斷裂缺失，核膜破裂，細胞基質稀少。磷酸肌酸組病變較膿毒癥組減輕，線粒體腫脹較輕，膜尚完整，嵴略稀疏，部分線粒體破壞，排列仍規則，肌絲結構排列尚規則。

3 討論

在臨床上，心肌細胞損傷及功能障礙是膿毒癥常見的并發癥，心功能障礙又會加劇膿毒癥病情且是影響膿毒癥預后的重要因素[4]。心肌細胞能量代謝障礙在心功能障礙和心肌細胞結構重建中發揮重要作用。能量的生成分為有氧氧化和無氧酵解，有氧氧化要在線粒體中完成，而無氧酵解主要在胞漿中進行。有氧氧化反應過程是從胞漿進入線粒體才完成的，葡萄糖6-磷酸酶是糖異生反應的限速酶之一，它存在于胞漿中，該酶活性反映了糖異生變化。ATP是維持心肌細胞泵血功能必需的物質，因為在心臟組織中儲存的ATP遠遠不能滿足心肌細胞收縮和舒張之需要，所以，心肌細胞心須不斷合成ATP以保持心肌細胞的有效功能。研究證實，在內毒素注射后1h[5]，大鼠心肌細胞G-6-PD活性增強，提示糖異生反應增強；注射后3小時，該酶的活性明顯下降，提示糖異生減弱。膿毒癥早期，機體處于高代謝狀態，組織細胞需氧量增多，而實際上因為存在微循環障礙及組織利用氧障礙等因素，組織獲取氧量減少。因此，組織通過有氧氧化而生成的ATP減少。機體為了增加ATP的生成，必然增強無氧酵解。本實驗中，因膿毒癥引起心肌細胞超微結構的變化，線粒體腫脹、破壞，有氧氧化減弱，ATP、ADP和AM P生成減少。隨著能量物質及其底物的消耗和線粒體功能結構的改變，胞漿中酶的含量和活性也發生了變化，G-6-PD活性下降，糖異生減弱，更進一步加快能量耗竭。

在心臟組織中，磷酸肌酸（Creatine Phosphate,CP）是最主要的能量合成底物，可生成細胞代謝所需的能源物質—三磷酸腺苷（ATP），并在線粒體到細胞質的能量運輸與分配中起著重要的作用。心肌損傷時所消耗的ATP要靠CP轉化來補充，所以，損傷時CP也同樣大量消耗，而心肌細胞本身儲備的CP是有限的，此時提供外源性CP參與損傷心肌的能量供應，可以解決損傷心肌最根本的能量代謝問題。外源性高能磷酸肌酸鹽已被普遍認為在體外循環手術中對心肌缺血有良好的保護作用，主要用于動物實驗和冠狀動脈搭橋手術病人[6-7]。本研究應用外源性磷酸肌酸治療膿毒癥大鼠，證實其能改善膿毒癥心肌能量代謝障礙和心肌的超微結構。

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