白藜蘆醇對高糖環境近端小管上皮細胞氧化應激的影響

王興紅 李德恒

糖尿病是我國中老年人常見的疾病，糖尿病腎病（d iabetic neph ropathy,DN）是糖尿病最為嚴重的并發癥之一，也是臨床上導致糖尿病患者死亡的主要原因之一。近年來隨著對自由基氧化損傷的不斷深入研究，證實氧化應激是糖尿病及并發癥發生的主要病理生理機制之一[1]。應用抗氧化治療，改善氧化應激可延緩糖尿病并發癥的發展。白藜蘆醇（Resveratrol，Res）是一種含有芪類結構非黃酮類多酚化合物，許多基礎研究和臨床觀察均表明，白藜蘆醇具有廣泛的藥理作用[2]。本實驗試圖觀察白藜蘆醇對高糖誘導的近端小管上皮細胞（p rox im al tubu le epithelial cells,PTEC）氧化應激的影響，進一步為白藜蘆醇防治DN的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性W istar大鼠，清潔級，標準飼養，自由飲水，日常光照。

1.1.2 試劑與儀器 白藜蘆醇，永州一東生物技術有限責任公司（＞98％）；優級胎牛血清，北京索萊寶科技有限公司；DM EM培養液，Giboc公司；DAB顯色試劑及SABC（Mouse IgG）試劑盒，武漢博士德公司；一氧化氮檢測試劑盒、過氧化氫檢測試劑盒、過氧化氫酶檢測試劑盒和還原型谷胱甘肽檢測試劑盒，均購自碧云天生物技術研究所；全自動酶標檢測儀，ELX 800型，美國。

1.2 原代近端小管上皮細胞的培養及鑒定 用手工微分離法分離大鼠單根近端小管，原代培養大鼠近端小管上皮細胞。將近端腎小管置入2m lDM EM培養液的培養瓶中，置于37℃5％CO2的培養箱中原代培養，于第3天更換第1次培養液，7～8d細胞基本鋪滿瓶底。免疫細胞化學SABC法鑒定細胞。

1.3 實驗分組 用MTT法檢測高糖和Res對細胞增殖的影響，由此選出高糖及藥物濃度。PTEC生長至基本鋪滿瓶底，將其消化并接種于96孔板，24h后更換為無血清DMEM低糖培養液培養24h使細胞同步化，以后將細胞分為以下三組：正常對照組（NC）（DMEM培養基），高糖組（25mmol/L），白藜蘆醇治療組（高糖+Res組），每組設6個復孔，作用72h后取樣觀察。

1.4 氧化應激指標的測定 分別用化學比色法測定PTEC的一氧化氮（n itrogen monox idum,NO）、過氧化氫（hyd rogen perox ide,H2O2）、還原型谷胱甘肽（redu ced g lu tath ione horm one,GSH）水平和過氧化氫酶（catalase,CAT）活性，均按照試劑盒說明書操作。

1.5 統計學方法 實驗數據均以均數±標準差（x±s）表示。全部資料用SPSS13.0統計軟件進行統計分析，組間比較用t檢驗和方差分析。檢驗水準a=0.05，P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 對PTEC氧化應激的影響NO水平 高糖組顯著高于NC組（P＜0.01），高糖+Res組與高糖組比較明顯降低（P＜0.05），與NC組比較無明顯差異；H2O2水平：高糖組顯著高于NC組（P＜0.01），高糖+Res組較NC組仍明顯升高（P＜0.05），但較高糖組明顯降低（P＜0.05）。見表1。

2.2 對PTEC抗氧化能力的影響 CAT活性：高糖組顯著低于NC組（P＜0.05），高糖+Res組較高糖組明顯升高（P＜0.05），與NC組比較無明顯差異；GSH水平：高糖組明顯低于NC組（P＜0.05），高糖+Res組較高糖組明顯升高（P＜0.05），與NC組比較無明顯差異。見表2。

3 討論

氧化應激是指機體組織或細胞內氧自由基生成增加或清除能力降低，導致活性氧家族（reactive oxygen species,ROS）在體內或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程。大量研究均表明，糖尿病存在明顯的氧化應激，氧化應激可能是糖尿病血管并發癥的始動因素,高血糖狀態下產生大量ROS[3]。目前臨床上對DN尚無根治的措施，主要是對癥治療和改善癥狀為主，療效并不十分滿意。采用中醫中藥的方法是我國在DN治療上的獨到優勢，白藜蘆醇在治療方面的作用尤其引人注目。盡管證實氧化應激在糖尿病血管并發癥中的主導作用，但抗氧化治療并不樂觀，藥物的選擇、劑量、療程、作用位點等因素都是尚待研究的重點。目前提出的抗氧化病因學治療有望成為主要的治療方案。

表1 各實驗組對PTEC氧化應激的影響±s）

表1 各實驗組對PTEC氧化應激的影響±s）

注：與NC組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與高糖組比較，#P＜0.05（下同）

組別 NO H2O2（umol/mg p ro） （umol/mg pro）NC組 0.24±0.11 5.29±2.03高糖組 0.71±0.24** 30.51±14.49**高糖+Res組 0.26±0.09# 12.34±7.68*#

表2 各實驗組對PTEC抗氧化能力的影響±s）

表2 各實驗組對PTEC抗氧化能力的影響±s）

組別 CAT GSH（umol/mg pro） （umol/mg pro）NC組 9.24±1.06 2.29±0.12高糖組 8.71±1.24* 1.69±0.05*高糖+Res組 9.26±0.49# 2.14±0.28#

本實驗結果顯示高糖環境培養的PTEC NO和H2O2水平明顯增加，白藜蘆醇加入高糖環境培養的PTEC NO和H2O2水平明顯受到抑制。王翠珍等[4]用CDNA探針與基因表達譜芯片雜交技術表明2型糖尿病大鼠腎臟組織某些抗氧化應激相關基因表達明顯降低，說明腎臟抗氧化防御機能減退、氧化應激作用增強在DN中起重要作用。NO是內皮細胞合成和釋放的一種內皮源性舒張因子，參與多種生理和病理過程，有強烈的舒血管作用，在調節腎血流動力學方面起重要作用，也在DN的病因學上有重要意義。Baines等[5]研究表明3～5周的糖尿病大鼠近端小管不僅一氧化氮合酶蛋白表達和其活性均升高。正常狀態下，腎臟有完整的抗氧化酶保護系統。Antonio等[6]研究發現，腎臟抗氧化防御機制的減弱可能在DN的發生、發展中起重要作用，其中CAT和GSH是兩種重要的抗氧化的物質，CAT主要清除高濃度的H2O2。已發現在糖尿病大鼠的大腦和心臟的CAT活性升高，但在肝臟和腎臟卻降低[7]。GSH是細胞內重要的還原劑，直接的自由基清除劑，把H2O2還原成H2O，其自身被氧化為氧化型谷胱甘肽。在用化學的方法誘導的糖尿病動物腎臟中GSH濃度降低。本研究也發現高糖環境培養的PTEC GSH水平與CAT活性均明顯降低，白藜蘆醇治療后可抑制PTEC的GSH水平和CAT活性的降低。

本實驗結果提示白藜蘆醇甙不僅有抑制氧化應激的作用，還有增強抗氧化能力。由此進一步表明白藜蘆醇甙具有防治DN的作用，這為抗氧化劑治療DN提供了理論依據，此作用可能通過抑制氧化應激和增強抗氧化的防治功能或別的途徑來實現的，其具體相關機制仍需要進一步的研究。

[1]劉影,田浩明.氧化應激與糖尿病[J].華西醫學,2007,22（1）：194-195.

[2]張寶紅.白藜蘆醇藥理研究進展[J].現代醫院,2008,8（3）：66-68.

[3]Yorek MA.The role of oxidative stress in diabetic vascular and neural disease[J].Ferr Radic Res,2003,37（5）：471-480.

[4]王翠珍,林麗香,陳剛,等.2型糖尿病大鼠腎臟組織氧化應激相關基因的表達[J].海峽預防醫學雜志,2005,11（2）：3-5.

[5]Baines A,Patrick HO.Glucose stimulate O2 consumpion,NOS,and Na/H exchange in diabetic rat proximal tubules[J].Am J Physiol Renal Physiol, 2002,283（2）：286-293.

[6]Antonio C,Anna M,Franceschina M,et al.Defective intracellular antioxidant enzyme production in type 1 diabetic patients with nephropathy[J].Diabetes,2000,（49）：2170-2178.

[7]Inoguchi T,Li P,Umeda F,et al.High glucose level and free fatty acid stimulate reactive oxygen species production through protein kinase C-dependent activation of NADPH oxidase in cultured vascular cells[J]. Diabetes,2000,49（11）：1939-1945.