兩種方法對上海及周邊地區實驗大小鼠螺桿菌攜帶情況的調查

丁 聰，馮 潔，謝建云，高 誠，3，胡建華

（1.揚州大學比較醫學中心，揚州 225009；2.上海實驗動物研究中心，上海市實驗動物質量監督檢驗站，上海 201203； 3.上海市計劃生育科學研究所，上海 200032）

螺桿菌菌屬（Helicobacter spp.）是一組最初從人類和其他哺乳動物胃中分離出來的革蘭氏陰性、微需氧、螺旋彎曲狀細菌，其中具有代表性的是H.pylori。根據它們喜好的定居部位，可被分為胃螺桿菌和腸肝螺桿菌（enterohepatic helicobacter species，EHS）［1］。自1992年Lee等人發現了鼠型螺桿菌以來，已從嚙齒類動物腸道中分離出了大量的螺桿菌屬新菌株。目前，已有20余種寄生于某些動物和人類胃腸道且有致病性的螺桿菌被正式命名。對嚙齒類而言，有肝型（H.hepacticus）、鼠型（H.muridarum）和膽型（H.bilis）。嚙齒類螺桿菌以隱性感染的形式廣泛存在于實驗大鼠、小鼠中［1］，被感染動物大多數以慢性、潛伏性感染為主，無明顯癥狀。現已有研究顯示這類細菌不僅在人或動物的胃炎、消化性潰瘍、胃惡性腫瘤的發生發展中起到致病作用，也可能與腸道、膽道、肝臟的炎癥性疾病和一些腫瘤的發生相關。已有報道實驗用嚙齒類動物普遍存在螺桿菌自然感染［2，3］。

在構建腫瘤模型和毒理實驗研究中，實驗大鼠、小鼠模型無意中感染螺桿菌將會嚴重影響實驗動物質量，影響實驗進程，對實驗數據的可靠性產生潛在干擾。在美國和歐洲，大鼠、小鼠群中螺桿菌有較高的流行率［3］。美國、日本、歐洲等發達國家，以及國際實驗動物理事會早已將其列為嚙齒類實驗動物必須排除的病原微生物。由于缺乏模式菌株和有效的檢測方法，我國實驗動物質量國家標準至今尚未將其列入。這嚴重妨礙了我國實驗動物事業的對外交流。因此，開展實驗動物螺桿菌的監測與控制，是保證實驗動物和動物實驗質量的重要前提。

本研究分別應用PCR和ELISA方法對上海及周邊地區實驗小鼠和實驗大鼠進行螺桿菌檢測，并對各自的陽性檢測率進行比較。旨在填補我國實驗大鼠、小鼠螺桿菌流行病學資料調查空白，分析評估實驗動物微生物學質量，進一步補充和完善實驗動物質量控制體系，為我國實驗動物等級及監測標準的制定提供參考和依據。

1 材料和方法

1.1 動物來源

所有檢測的實驗大鼠、小鼠來自上海、江蘇、浙江地區不同實驗動物生產單位，級別有清潔級和SPF級。

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技公司；PCR所用試劑：Taq酶、dNTP、PCR buffer，DNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司；大鼠、小鼠螺桿菌抗體 I gG檢測試劑盒（血清 E LISA試劑盒）購自美國EBI公司。

1.3 樣品采集

無菌采取實驗大鼠、小鼠的血液，分離血清，同時采集回盲部內容物。血清樣品-20℃凍存；回盲部內容物-80℃凍存，備用。

1.4 大鼠、小鼠回盲部內容物中螺桿菌核酸檢測——PCR法檢測

1.4.1 提取回盲部內容物螺桿菌總DNA：取0.2 g回盲部內容物，懸浮于1 mL的PBS（pH 7.4）中制成細菌懸液，然后按照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書嚴格操作。

1.4.2 引物：根據螺桿菌屬特異性16SrRNA基因，合成1對引物［4］編號為：

P7：5＇-CTATGACGGGTATCCGGC-3＇

P8：5＇-ATTCCACCTACCTCTCCCA-3＇

引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

1.4.3 反應體系：20μL體系內含2μL 10×PCR buffer，1.6μL dNTP（each 2.5 mmol/L），引物P7、P8（10 pmol/L）各1μL，0.3μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），3μL DNA模板，11.1μL滅菌雙蒸水。

1.4.4 反應條件：擴增程序為95℃預變性5 min，95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物經濃度為1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。目的產物大小為374 bp。

1.4.5 PCR產物測序：隨機抽取陽性PCR產物經凝膠電泳回收純化后送至上海英駿生物有限公司測序。

1.5 大鼠、小鼠血清抗螺桿菌 IgG抗體檢測（ELISA法）

具體操作和結果判定均嚴格按美國EBI公司試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 大鼠、小鼠回盲部內容物中螺桿菌抗原PCR擴增結果

共檢測小鼠352只，其中清潔級101只，SPF級251只；共檢測大鼠101只，其中清潔級69只，SPF級32只。其詳細結果見表1。隨機抽取陽性樣本測序，結果登錄NCBI中進行BLAST比對，與螺桿菌菌屬16SrRNA序列的同源性均在98％～100％之間，部分樣品PCR檢測結果見圖1。

2.2 大鼠、小鼠血清抗螺桿菌抗體ELISA檢測結果

應用ELISA法共檢測小鼠88只，其中清潔級26只，SPF級62只；共檢測大鼠165只，其中清潔級84只，SPF級81只。其詳細結果見表2。

表1 不同級別大鼠、小鼠糞便中螺桿菌抗原陽性率分析Tab.1 The positive rates of Helicobacter spp.antigen in the feces from different grade rats and mice

圖1 部分樣品PCR檢測結果注：泳道1，2，4-13，15，17-21：被檢陽性樣品；泳道3，14，16：被檢陰性樣品；泳道22：陰性對照；泳道23：陽性對照；M：DNA分子量標準DL2000Fig.1 The Results of some samples detected by PCRNote：1，2，4-13，15，17-21.The clinical positive samples；3，14，16.The clinical negative samples； 22.Negative control；23.Positive control；M.DNA marker DL2000.

表2 不同級別大鼠、小鼠血清抗螺桿菌抗體陽性率分析Tab.2 The positive rates of serum Helicobacter spp. antibody in different grade rats and mice

2.3 大鼠、小鼠螺桿菌PCR和ELISA的陽性檢測率比較

對88只小鼠，101只大鼠分別同時進行PCR和ELISA的檢測，結果88只小鼠PCR陽性檢測率為72.7％（64/88），ELISA陽性檢測率為15.9％（14/ 88）；101只大鼠PCR陽性檢測率為70.3％（71/ 101），ELISA陽性檢測率為49.5％（50/101）。

3 討論

嚙齒類螺桿菌是革蘭氏陰性，螺桿狀，微需氧菌，培養條件苛刻，該菌呈潛伏性感染。國外已有大量報道大鼠、小鼠種群感染螺桿菌的比例呈增長趨勢［5］，雖然螺桿菌感染可能會導致臨床疾病，但由于螺桿菌所產生的病理現象是宿主依賴型的，在臨床上很少被察覺，因此常發生實驗人員不知道實驗大鼠、小鼠已感染螺桿菌的情況。螺桿菌感染的影響不僅局限于胃腸系統，也可能對繁殖、胃腸器官及其它器官如乳腺的腫瘤發展、疫苗免疫應答以及其它方面產生影響。已有大量數據顯示，大鼠和小鼠模型無意中感染螺桿菌將會對實驗數據的可靠性產生潛在干擾。因此，研究機構應定期檢查實驗大鼠和小鼠是否感染螺桿菌并將這些病原體清除［5，6］。目前，實驗室嚙齒類螺桿菌檢測方法主要是細菌學分離培養、組織病理學、生化鑒定或電鏡觀察早期螺桿菌感染情況、免疫學方法（如ELISA）檢測感染后期的特異抗體以及分子生物學方法。傳統的生化鑒定方法比較簡單，但操作繁瑣，檢測周期一般為1～2周，即使應用商業化的快速鑒定試條也需要5～6 d。PCR方法和免疫學方法相對簡單。

本研究通過檢測大鼠和小鼠回盲部內容物中螺桿菌抗原和血清中抗螺桿菌抗體，對大鼠和小鼠中螺桿菌攜帶率進行了分析和評價。PCR方法檢測結果顯示，大鼠螺桿菌平均陽性率高于小鼠平均陽性率；小鼠中清潔級陽性率高于SPF級；大鼠中SPF級陽性率略高于清潔級。血清中抗螺桿菌抗體ELISA檢測結果也顯示，大鼠螺桿菌平均陽性率高于小鼠平均陽性率。清潔級大鼠和小鼠血清中抗螺桿菌抗體陽性率皆高于SPF級。國外有報道螺桿菌在實驗小鼠上有較高的攜帶率，SPF級實驗小鼠中腸肝科螺桿菌的檢出率達到87.5％，并且動物之間交叉感染率達到100％［7］。此次我們調查結果顯示上海及周邊地區大鼠的螺桿菌攜帶率高于小鼠，可提示這些地區今后要進一步加大對大鼠螺桿菌的定時監測與飼養管理力度，同時也為我國實驗動物螺桿菌等級標準的制定提供了一定參考和依據。

比較兩種方法的陽性檢出率結果可以看出PCR法的陽性檢出率要高于ELISA法，這與國內外的研究均相符［8，9］。螺桿菌是經糞口途徑傳播，長期存在于動物腸道及糞便中，先天的體液及細胞介導的免疫反應不能清除螺桿菌感染［10］。但應注意到糞便和腸道中含有一些PCR反應的抑制物，提高模板DNA的純度可直接影響PCR的敏感性。PCR檢驗是以檢測病原基因為目標，屬“病因”診斷，因而針對性強，對在體外難培養的螺桿菌，此方法特別有效，適合于進行螺桿菌流行病學調查。ELISA方法的特異性和敏感性較好，血清學方法具有無創傷和重復性好的優點，但由于抗體的持續存在和產生時間，使血清學存在一定的假陽性和假陰性。在本次研究中就發現PCR法檢測均陰性的30只大鼠和24只小鼠中ELISA法分別檢出了15只陽性大鼠和2只陽性小鼠，ELISA法檢測均陰性的51只大鼠和74只小鼠中PCR法分別檢出了36只陽性大鼠和52只陽性小鼠。國外的相關研究也都表明血清學不太適合嚙齒類螺桿菌根除判斷，可用作螺桿菌感染后期的初篩，PCR法可用于大鼠和小鼠感染螺桿菌最終診斷結果的判定。目前，PCR方法是最快最敏感的檢測螺桿菌的方法［9］。

綜上所述，不同檢測方法的調查結果皆表明，上海及周邊地區大鼠螺桿菌的攜帶率高于小鼠，大鼠和小鼠中存在著不同程度的螺桿菌感染，這也與張麗芳、Goto等人的文獻報道相符［7，11，12］。兩種方法陽性檢出率比較結果表明回盲部內容物PCR法較血清抗螺桿菌抗體ELISA檢測法更為敏感。因此，應用PCR檢測大鼠和小鼠中螺桿菌DNA是可行的，且具有較高的特異性。本次研究也表明，在加強PCR引物、試劑和操作的標準化前提下，PCR檢測方法可以用于大鼠和小鼠螺桿菌的初步調查和流行病學監測，從而為我國實驗動物螺桿菌的感染狀況提供有用的流行病學數據，這也有助于實驗動物種群中螺桿菌隱性感染的及時監測，從而進一步降低或減少對實驗數據的潛在干擾。

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