氣管插管法接種H5N1病毒感染恒河猴及系統組織病毒檢測

呂 琦，鄧 巍，鮑琳琳，許黎黎，李楓棣，陳 霆，占玲俊，秦 川

（中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

高致病性禽流感病毒H5N1的危害不僅在于其能夠引起禽類的大量死亡，更嚴重的是它跨越了物種屏障，多次造成人類感染并引起死亡，致死率高達60％以上［1，2］。人類感染禽流感的風險也隨著全球動物禽流感疫情的不斷增加而增大，應該引起重視的是，隨著病毒的不斷變異，能導致人間傳播的可能性也在增加，因此對禽流感發病機制研究，以及藥物和疫苗的評價篩選成了當務之急，而這些研究都需要合適的動物模型。非人靈長類實驗動物以其具有與人類最為相似的生理結構和免疫學應答，已被用作禽流感感染動物模型，但有文獻報道該模型對H5N1病毒的敏感性較低［3，4］，不能完全模擬人類重癥患者的發病特征。考慮到感染途徑最有可能影響感染效果，本研究探索應用氣管插管的新式感染H5N1病毒方法感染恒河猴，旨在改良以往模型的低敏感性，并密集動態檢測病毒在體內的分布，為深入研究禽流感發病機制，篩選有效疫苗和治療藥物提供一個良好的技術平臺。考慮到人源H5N1的高度致病性和感染大動物生物安全的控制要求，本實驗在前期實驗的基礎上，使用2只恒河猴，在病毒復制和疾病凸顯節點安樂處死動物，系統檢測多項組織病毒分布。

1 材料和方法

1.1 病毒毒株

高致病性禽流感病毒H5N1 A/SZ/406H/2006株，由WHO惠贈，在本實驗室經10日齡SPF級雞胚傳代擴增，MDCK細胞測定TCID50為108/m L，液氮中保存備用。

1.2 動物

恒河猴（許可證號：IACUC-MC-07-6011）年齡5歲，雄性，2只，動物編號為001和002。H5N1、H1N1和季節性流感病毒抗體經檢測均呈陰性。實驗前恒河猴麻醉后將體溫芯片植入其頸部后方、肩胛骨上方的背中線位置，每天用數據收集器掃描芯片來測量猴的體溫。

1.3 方法

1.3.1 病毒感染：感染前按照10 mg/kg復方氯胺酮肌肉注射給予猴麻醉，待恒河猴肌肉徹底放松后，將其放置仰臥位，用喉鏡撐開會厭，通過氣管插管將2 m L H5N1（2x108TCID50）病毒液滴入上呼吸道。所有操作均在ABSL-3實驗室內完成（許可證號：ⅡBSL3-006）。

1.3.2 臨床觀察：每天從以下幾方面觀察恒河猴的感染后癥狀：（1）體溫，每天上午相同時間點通過芯片讀取體溫；（2）鼻部癥狀，有無流涕；（3）上呼吸道癥狀，有無咳嗽、氣促、呼吸困難；（4）消化道癥狀，有無嘔吐、腹瀉；（5）攝食量，有無明顯食欲缺乏；（6）精神狀態，有無精神萎靡及活動度減退等癥狀。

1.3.3 取樣：恒河猴感染1 d后，每天采集其咽拭子和鼻灌洗液放入1 m L DMEM溶液中，2 000 r/m in離心10 min取上清液，-80℃保存待檢。感染前2 d、感染后第3、5和7天分別靜脈取血，血液放置30 min后，2 000 r/min離心10 min，-80℃保存待檢。感染第3天和第7天各解剖1只恒河猴，取支氣管淋巴結、腸淋巴結、鼻甲、心、肝、脾、肺、腎、腸、氣管、腦組織，每個組織各剪取50 mg左右兩小塊，一塊放入1 m L DMEM中用于病毒分離，另一塊放入1 m L buffer RLT（Qiagen，已加入1％巰基乙醇）用于核酸載量檢測，研磨成組織勻漿后3 000 r/min離心10 min，取上清-80℃保存待檢。

1.3.4 病毒分離和核酸載量的檢測：病毒分離方法：取咽拭子鼻灌洗液處理后溶液、血清及組織勻漿上清100μL接種于鋪滿75％以上MDCK細胞的24孔板中，每個樣品設3個復孔，并設兩個正常細胞對照孔，置于37℃含5％CO2的培養箱中孵育。1 h后DMEM培養液洗1次，加入1.9 m L病毒生長液后再次置于37℃含5％CO2的培養箱中培養，每天觀察細胞病變（CPE），持續觀察7 d，如無CPE，將原代24孔板培養物-80℃凍融2次再盲傳二代，共盲傳三代后仍不出現CPE視為陰性，血凝實驗確認。核酸載量檢測方法：取咽拭子鼻灌洗液處理后溶液、血清及組織勻漿上清100μL放入250μL RLT中，按Qiagen試劑盒法提取樣品RNA，將RNA逆轉錄成cDNA（逆轉錄試劑盒購自Invitrogen），通過熒光定量PCR儀直接測定病毒載量（RT-PCR試劑盒購自ABI）。病毒分離及RNA提取操作步驟均在ABSL-3實驗室內完成。

1.3.5 血常規：血常規檢測感染前2 d感染后第3、5和7天靜脈采集的恒河猴血液。

2 結果

2.1 臨床癥狀

感染后第2天恒河猴攝食量開始減少、自主活動減少。感染后第1天體溫達到峰值，第3天時回落至正常范圍，除以上癥狀外恒河猴未出現其他明顯臨床表現（圖1）。

圖1 感染后恒河猴體溫變化情況Fig.1 Body temperature of the monkeys post-infection

2.2 病毒分離和載量的檢測

2.2.1 鼻灌洗液和咽拭子的病毒分離和核酸載量檢測結果：H5N1感染1 d后，每天采集鼻灌洗液和咽拭子至第7天，病毒培養鼻灌洗液除第4、5天為陰性結果外，其余均為陽性。咽拭子除第7天為陰性外第1～6天均為陽性（表1）。病毒陽性的細胞形態表現為：腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或破裂，細胞部分或全部脫落，血凝實驗中紅細胞也發生凝集現象。病毒載量結果顯示鼻灌洗液及咽拭子于感染后第1天載毒最高，此后逐漸下降（表2）。

2.2.2 血液的病毒分離和核酸載量檢測結果：恒河猴感染H5N1病毒前2 d及感染后第3、5和7天靜脈取血，002號恒河猴在感染后第3天血液中H5N1病毒分離成陽性，血凝實驗復檢結果一致。核酸載量也達104copies/m L（表3）。

2.2.3 組織器官的病毒分離和核酸載量檢測結果：H5N1感染后第3天和第7天各安樂一只恒河猴，剖取支氣管淋巴結、腸淋巴結、鼻甲、心、肝、脾、肺、腎、腸、氣管、腦組織進行病毒分離和核酸載量檢測。除肺組織外，在恒河猴的心，氣管，腦，肝，腎，腸多處組織器官中也能分離到H5N1病毒（表4），血凝試驗復檢結果一致。病毒載量檢測結果顯示，所取組織中均存在高達105～107copies/g的H5N1核酸拷貝（表5）。

2.3 血常規

恒河猴感染H5N1病毒前2 d及感染后第3、5、7天采靜脈血，進行血常規檢測，結果如表6所示。感染后與感染前相比恒河猴白細胞數及淋巴細胞數下降，其他指標均無明顯變化。

表1 感染后恒河猴鼻灌洗液和咽拭子的病毒分離情況Tab.1 Virus isolation in the throat swab and nasal wash obtained from rhesusmacaques post-infection

表2 感染后恒河猴鼻灌洗液和咽拭子的病毒載量 單位：log10（copies/g） Tab.2 RT-PCR Resultsof the throat swab and nasal wash obtained from rhesusmacaques post-infection（log10 copies/g）

表3 感染后恒河猴血液的病毒分離和病毒載量（病毒分離/病毒載量 單位log10（copies/m L）） Tab.3 Virus isolation and RT-PCR Results of the blood obtained from rhesusmacaques post-infection（Virus isolation/RT-PCR log10 copies/m L）

表4 感染后恒河猴組織樣品的病毒分離情況Tab.4 Virus isolation in organ tissues obtained from the rhesusmacaques post-infection

表5 感染后恒河猴組織樣品的病毒載量 單位：log10（copies/g） Tab.5 RT-PCR Results of the organ tissues obtained from rhesus macaques post-infection（log10 copies/g）

表6 感染后恒河猴血常規各項指標的變化Tab.6 Changes of blood physiological parameters in the rhesus macaques post-infection

3 討論

Yunxin Chen、代小偉等［3，4］人已成功建立了H5N1感染恒河猴模型，但病理變化以及病毒學檢測結果顯示H5N1只能在呼吸系統復制，恒河猴感染敏感性較低。針對以上不足本研究嘗試性選取了一種新的感染方法及一株人源高致病性H5N1病毒經氣管插管滴入的方式感染恒河猴，通過分析臨床癥狀、病毒分離情況、血常規變化等檢測指標，研究此方法感染恒河猴的臨床及病毒變化，為H5N1的深入研究及提供更具理論指導意義和實際應用價值的動物模型做前期摸索。

人感染禽流感病毒后的癥狀表現為多樣化［1，2］，從臨床癥狀分析本實驗感染后的恒河猴出現一過性體溫升高、攝食量減少、自主活動減少，表現為普通型的流感癥狀，并未出現其他明顯臨床癥狀。從病毒分離和核酸載量檢測結果看，氣管插管法感染的這株人源H5N1病毒侵襲機體的特點是系統性的，恒河猴全身多組織臟器包括心、肝、腎、小腸、氣管和腦都能分離到病毒，不僅局限于肺部。而之前建立的H5N1感染恒河猴模型在急性感染期只有肺組織分離到病毒，引起這種差別的主要原因可能包括三方面：

首先，造成肺外感染的原因可能是感染途徑的不同，Rimmelzwaan等［6］人利用滴鼻、上呼吸道感染和左右眼球感染，這種聯合攻毒方式導致動物所表現的臨床癥狀和組織病理學都嚴重于只滴鼻感染的獼猴。對于同樣是呼吸道感染方式，環甲膜穿刺對于機體有一定的微創性，并造成黏膜損傷，可能對病毒結合呼吸道受體有一定影響，而本研究所采用的氣管插管可直接定位于上呼吸道，能準確控制感染劑量，對機體是無創性的，是很好的感染途徑。

其次，病毒來源不同也會造成病毒侵襲力的不同，Hualan Chen等人將三種不同來源的H5N1病毒株以3滴鼻方式等劑量感染恒河猴［7］，只有感染了其中一種病毒的恒河猴出現了肺外感染。本實驗采用的高致病性禽流感病毒H5N1為一株人源毒株，而此前感染的毒株多為禽源性，因不同毒株致病力有所不同，所以導致了病毒對于機體侵襲力的不同。

恒河猴體內出現的病毒血癥提示血液的流通可能將病毒帶到了各個組織臟器中，病毒血癥出現的原因至今尚不清楚，根據Menno Dde Jong等人將感染H5N1的患者與感染兩種人季節性流感病毒的患者進行比較發現，感染H5N1患者咽部病毒載量顯著高于季流患者，病死H5N1患者體內病毒載量水平最高，并在死亡患者血液中可以檢測到H5N1病毒。本實驗中恒河猴咽部分離的病毒載量也相對較高，但咽部的高病毒載量是否與病毒血癥具有相關性還需進一步實驗驗證。通常病毒血癥的出現一般在致死性的重癥感染中［3，5］，而本實驗猴只出現了輕微的臨床癥狀，可見病毒血癥的出現并不一定會造成嚴重的癥狀。在本實驗中只有一只猴出現病毒血癥，考慮到采血時間過于密集會導致猴的生理損傷而影響結果的判定，所以并不排除另一只猴因采血時間點的不密集也出現過病毒血癥。

對于H5N1感染腦部的病毒分離結果，之前Haeman J基于小鼠的實驗顯示［8］，H5N1型禽流感病毒具有嗜神經性，可以感染包括腦細胞在內的神經細胞，能夠引發中樞神經系統蛋白質聚集紊亂，導致帕金森和老年癡呆癥。他們還發現，禽流感的致死性更在于其肺外組織感染能力，尤其是大腦。本實驗中也在感染急性期的恒河猴腦部中分離到H5N1病毒，進一步用基于非人靈長類的動物模型驗證了H5N1能夠跨越血腦屏障這一推測。

經氣管插管感染的恒河猴感染急性期全身多組織臟器都可分離到H5N1病毒，血液中也出現了病毒血癥，而禽流感的致死性之一也在于其肺外傳播能力，導致的多組織、臟器損傷，并且病毒血癥可能就是造成這種傳播的主要原因，所以氣管插管感染的恒河猴對于進一步研究H5N1病毒的致病機制，及病毒血癥與病毒體內傳播的相關性具有重要的現實應用價值。

由于人源H5N1具有高度致病性，特別是進行感染大動物時，如實驗猴，生物安全控制要求非常嚴格，因此，本試驗僅使用2只恒河猴，在病毒復制和疾病凸顯節點安樂處死動物，密集檢測多項組織中的病毒分布，初步了解了該方法的有效性和感染病毒的特性，為更深入、全面建立動物模型等提供了良好的實驗依據。

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