采用微滲透泵測(cè)定清醒大鼠腎小球?yàn)V過率

王靜波，王海濤，汪照寒

（1.沈陽市第六人民醫(yī)院肝硬化病房，沈陽 110006；2.沈陽醫(yī)學(xué)院附屬沈洲醫(yī)院普外科，沈陽 110001； 3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院傳染科，沈陽 110005）

血液流經(jīng)腎小球?yàn)V過膜后形成超濾液，即開始了尿液的生成，超濾液形成比率即腎小球?yàn)V過率（GFR），是評(píng)估腎臟功能、判斷腎臟疾病進(jìn)程的重要參考指標(biāo)之一。沒有生物學(xué)活性、能夠自由通過腎小球?yàn)V過屏障、在腎小管既不被重吸收也不被再分泌的物質(zhì)，是測(cè)定GFR的理想標(biāo)記物。很多種物質(zhì)被用于測(cè)定GFR，如內(nèi)源性物質(zhì)——肌酐和胱抑素 C［1，2］，還有外源性物質(zhì)——菊粉、熒光標(biāo)記的EDTA和左旋糖等等［3，4］，其中菊粉清除率被認(rèn)為是評(píng)價(jià)腎臟功能的金指標(biāo)。GFR測(cè)定主要有兩種方法：①測(cè)定標(biāo)記物的尿排泄率［1，5］；②標(biāo)記物單劑負(fù)荷量注入靜脈后，根據(jù)其血液動(dòng)力學(xué)變化測(cè)定清除率［6］。

在過去的十幾年中，隨著遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，通過整合嚙齒類動(dòng)物基因組序列構(gòu)建疾病模型，使多種疾病的研究不斷深入［7，8］。然而，由于缺少簡(jiǎn)單易行的GFR測(cè)定方法，使得腎臟疾病的研究相對(duì)滯后。由于嚙齒類動(dòng)物血容量有限、血中含有高濃度內(nèi)源性非肌酐類似物，不宜用肌酐清除率測(cè)定 GFR［7，9］。本研究中，我們用熒光素異硫氰酸酯（FITC）標(biāo)記菊粉（FITC-菊粉）作為標(biāo)記物，通過微滲透泵技術(shù)，在大鼠清醒狀態(tài)下通過測(cè)定FITC-菊粉尿排泄率計(jì)算GFR。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠（體重200±20 g，購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-2007-0040），F(xiàn)ITC-菊粉（Sigma公司，美國(guó)），微滲透泵 （Alzet，model 2001），代 謝 籠（Columbus Instrument，美國(guó)），透析袋（聯(lián)合碳化公司）。

1.2 FITC-菊粉溶液的準(zhǔn)備

FITC-菊粉（24％）在沸水中溶解于生理鹽水，吸入MWCO 1，000透析袋中，在1 000 mL生理鹽水中室溫過濾24 h。為避光盛透析液的燒杯外包鋁箔紙。由于水分自由擴(kuò)散作用，透析液擴(kuò)散至透析袋內(nèi)，使袋內(nèi)FITC-菊粉溶液濃度由24％降至8％。吸出透析袋內(nèi)FITC-菊粉溶液，用0.22μm針頭式過濾器過濾滅菌。

1.3 微滲透泵的植入

將稀釋后終濃度為8％的FITC-菊粉溶液注入泵內(nèi)，并于生理鹽水中浸泡4～6 h。大鼠麻醉后（0.8％戊巴比妥鈉，40 mg/kg，腹腔注射）置于暖床上，腹部剃毛，碘伏消毒。沿腹中線在肋窩下剪開一個(gè)0.5 cm的切口，把2個(gè)裝有上述FITC-菊粉溶液的微滲透泵分別置于腹腔左右兩側(cè)，逐層縫合切口，分籠飼養(yǎng)，每天查看術(shù)后大鼠狀態(tài)并稱量體重。

1.4 血液和尿液的收集

植泵后第7天將大鼠隨機(jī)分成2組（每組10只），其中一組先收集 24 h尿液，用 500 mmol/L HEPES液洗刷代謝籠2次，收集殘留在代謝籠上的FITC-菊粉。24 h尿液標(biāo)本收集結(jié)束時(shí)，采用 Hem等［10］介紹的方法通過隱靜脈采集血液標(biāo)本。將大鼠放入頂端帶有通氣口的100 m L玻璃管中，兩條后腿露在管外，股內(nèi)側(cè)刮毛，碘伏消毒，隱靜脈采血大約1.5 mL，離心后（4 000 r/min，10 min）收集血清。另外一組不收集尿液僅采集血液標(biāo)本。裝標(biāo)本的試管注意外包鋁箔紙避光。

1.5 血清和尿液標(biāo)本FITC熒光量的測(cè)定

為避免pH值對(duì)FITC熒光值測(cè)定的影響，所有血液和尿液標(biāo)本均用pH 7.4的500 mmol/L HEPES緩沖液調(diào)定 pH值。一般在400μL尿液或血清中加入100μL HEPES緩沖液，混合液的 pH值仍為7.4。然后將500μL上述混合液吸入杯中，熒光分光光度計(jì)測(cè)定FITC熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)538 nm。

1.6 FITC熒光值與菊粉濃度相關(guān)性的檢測(cè)

通過檢測(cè)已知濃度的 FITC-菊粉溶液的 FITC熒光值來確定兩者的相關(guān)性。對(duì)于尿液標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為（0～120）μg/m L，400μL尿液標(biāo)本中加入上述范圍內(nèi)不同濃度的 FITC-菊粉溶液100μL，用pH 7.4的500 mmol/L HEPES緩沖液調(diào)定pH值至7.4。對(duì)于血液標(biāo)本，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為（0～300） μg/m L，400μL血清中加入上述范圍內(nèi)不同濃度的FITC-菊粉溶液 1 00μL，用 p H 7.4的 5 00 mmol/L HEPES緩沖液調(diào)定pH值至7.4。采用線性回歸分析，相關(guān)系數(shù)分別為0.99、0.98，確定尿液和血液中FITC熒光值與菊粉濃度之間密切相關(guān)。

1.7 FITC-菊粉溶液穩(wěn)定性的檢測(cè)

通過測(cè)定濾過液中FITC熒光值來驗(yàn)證溶液中FITC-菊粉結(jié)合的穩(wěn)定性。將過濾后的 F ITC-菊粉溶液室溫下繼續(xù)濾過7 d，分別在第1、3、5、7天測(cè)定過濾液中FITC熒光值，計(jì)算該值占過濾液中總FITC熒光值的比例，分別為0.89％、0.91％、1.18％和1.43％。第1天和第7天無明顯不同，所以植泵7 d時(shí)間里FITC與菊粉結(jié)合穩(wěn)定。

1.8 計(jì)算GFR

參照文獻(xiàn)［6，11］，用兩種方法計(jì)算GFR：①需要收集24h尿量，GFR1=UFITC-inulin·V/PFITC-Inulin（UFITC-Inulin為尿液中 F ITC熒光值，V為 2 4 h尿量，PFITC-Inulin為血清中 F ITC熒光值）；②無需收集 2 4 h尿量，GFR2=R/［Iss］（R為FITC-菊粉溶液泵入速率，［Iss］為血清FITC-Inulin濃度）。GFR計(jì)量單位為mL/min，體重校正后為m L/min·kg（大鼠體重），雙腎重量校正后為m L/min·g（大鼠雙腎重量）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 微滲透泵植入腹腔后第1天大鼠體重明顯下降，第3天體重開始增加，第4天恢復(fù)至植泵前，第7天體重平均增加（9.5±1.3）g。

2.2 植泵后第7天，采用收集24 h尿量方法計(jì)算GFR為2.31±0.33 mL/min；采用無需收集尿量方法計(jì)算GFR為2.53±0.33 m L/min（表1），兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1A）。分別用大鼠體重和雙腎重量校正后，兩種方法計(jì)算出的GFR之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1，圖1B～1C）。

3 討論

腎小球?yàn)V過率（GFR）是評(píng)估腎臟功能的主要參考指標(biāo)之一。菊粉清除率被認(rèn)為是測(cè)定GFR的金標(biāo)準(zhǔn)，因?yàn)榫辗勰軌蜃杂赏ㄟ^腎小球?yàn)V過膜，在腎小管內(nèi)既不被重吸收也不被分泌。用FITC標(biāo)記后可以檢測(cè)出血中微量菊粉，提高檢測(cè)靈敏度。之前有學(xué)者應(yīng)用FITC-菊粉在麻醉狀態(tài)下成功測(cè)定大鼠GFR［12，13］。檢測(cè)GFR主要有兩種方法：（1）負(fù)荷劑量菊粉一次性注入后利用FITC-菊粉血漿清除動(dòng)力學(xué)，測(cè)定菊粉清除率。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要收集24 h尿量，也不需要手術(shù)。（2）測(cè)定FITC-菊粉尿排泄率，是本研究采用的方法。在大鼠腹腔內(nèi)植入微滲透泵（Alzet微滲透泵是一次性使用囊性無菌微滲透泵，容積為（200±8）μL，恒定泵入速率1 μL/h，使用時(shí)間7 d），將FITC-菊粉溶液持續(xù)勻速泵入腹腔，通過腹膜吸收入血，菊粉在體內(nèi)逐漸蓄積，當(dāng)入血速率與尿液排泄速率達(dá)到平衡時(shí)，即植泵后第7天，血液中FITC-菊粉濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)，此時(shí)測(cè)定血清中FITC熒光量計(jì)算GFR。本研究采用兩種方法計(jì)算GFR：（1）用FITC-菊粉溶液的泵入速率除以穩(wěn)態(tài)時(shí)血清中菊粉濃度，此方法不需要收集24 h尿量；（2）用尿液中菊粉濃度除以血清中菊粉濃度，再乘以24 h尿量，此方法需要收集24 h尿量。通過分析發(fā)現(xiàn)此兩種方法計(jì)算出來的GFR數(shù)值相近。

表1 大鼠GFR數(shù)值（±s，n=10）Tab.1 GFR values of the rats（±s，n=10）

表1 大鼠GFR數(shù)值（±s，n=10）Tab.1 GFR values of the rats（±s，n=10）

UFITC-Inu lin，尿液中FITC熒光值；V，24 h尿量；PFITC-Inu lin，血清中FITC熒光值；R，F(xiàn)ITC-菊粉溶液泵入速率；［Iss］，穩(wěn)態(tài)后血清中FITC熒光值；BW，大鼠體重（kg）；KW，大鼠雙腎重（g）；P值定義為0.05

腎小球?yàn)V過率1 GFR1 （UFITC-Inu lin·V/PFITC-Inu lin）腎小球?yàn)V過2 GFR2 （R/［Iss］） P值P value GFR1 vs GFR2腎小球?yàn)V過率GFR（m L/min）2.31±0.33 2.53±0.33 0.207 GFR，m L/min·kg大鼠體重 11.13±1.53 11.66±1.32 0.462 GFR，mL/min·g大鼠雙腎體重1.23±0.11 1.29±0.12 0.146

表2 已發(fā)表文獻(xiàn)中大鼠GFR數(shù)值Tab.2 Rat GFR values published in the literature

圖1A 采用微滲透泵通過兩種方法測(cè)定清醒大鼠GFR（mL/min） GFR1采用搜集24 h尿量方法測(cè)定的GFR，GFR2采用無需搜集24 h尿量方法測(cè)定的GFR，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P出=0.098）.Fig.1A GFR in the conscious rats determined by twomethods using micro-osmotic pumping（mL/min）.GFR1 determined by collecting 24-hour urine；GFR2 determined without collecting 24-hour urine，P＞0.05，there was statistically no significant difference between the GFR values obtained by two methods.

圖1B 采用微滲透泵通過兩種方法測(cè)定清醒大鼠GFR（m L/min·kg體重） GFR1采用搜集24 h尿量方法測(cè)定的GFR，GFR2采用無需搜集24 h尿量方法測(cè)定的GFR，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.115）.BW，大鼠體重（kg）.Fig.1B GFR in the conscious rats determined by two methods using m icro-osmotic pumping（m L/min·kgBW）.GFR1：determined by collecting 24 hour urine；GFR2：determined without collecting24-hour urine.BW：body weight.P＞0.05，there was statistically no significant difference between the GFR values obtained by twomethods.

圖1C 采用微滲透泵通過兩種方法測(cè)定清醒大鼠GFR（m L/min·g大鼠雙腎重量） GFR1采用搜集24 h尿量方法測(cè)定的GFR，GFR2采用無需搜集24 h尿量方法測(cè)定的GFR，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.121）.KW，大鼠雙腎重量 （ g）.Fig.1 CGFR in the conscious rats determined by two methods using micro-osmoticpumping（m l·min·g KW-1） GFR1：determined by collecting 24-hour urine；GFR2：determ ined without collecting 24-hour urine.KW：kidney weight.P＞0.05，there was statistically no significant difference between the GFR values obtained by twomethods.

關(guān)于大鼠GFR測(cè)定的研究很少，尤其是清醒狀態(tài)下測(cè)定GFR。從已發(fā)表的文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)大鼠GFR變化范圍很大（表2），主要與以下因素相關(guān)：（1）性別［16，17］，（2）種屬［18］，這是由于性別、種屬不同體重及腎臟的大小亦不同，GFR通過體重、腎臟重量校對(duì)后，該差異可被糾正；（3）麻醉［19，20］，GFR是一個(gè)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可以隨生理因素的變化而改變，其中最主要的是腎血流量減少引起的腎小球血流動(dòng)力學(xué)改變，據(jù)Bouby［21］等報(bào)道清醒狀態(tài)下的GFR僅僅是麻醉狀態(tài)下的60％左右。本研究大鼠在清醒狀態(tài)下泵入菊粉溶液，并且在清醒狀態(tài)下收集血液及尿液標(biāo)本，除外麻醉對(duì)GFR的影響。我們測(cè)得的GFR數(shù)值為2.31mL/min、體重校正后為11.13 m L/min· kg體重，低于報(bào)道的SD大鼠GFR均值3.24mL/m in和12.81 m L/min·kg體重，大約降低了30％～40％，與Bouby等［21］的報(bào)道相符。考慮與采集標(biāo)本時(shí)大鼠處于清醒狀態(tài)而非麻醉狀態(tài)有關(guān)，證明了麻醉對(duì)GFR有較明顯的影響。

總之，用FITC標(biāo)記菊粉采用微滲透泵技術(shù)，測(cè)定清醒狀態(tài)下大鼠GFR，當(dāng)菊粉濃度在血中達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)，采用無需收集24 h尿量和需要收集尿量?jī)煞N方法計(jì)算出來的GFR相近；在去除麻醉影響后，GFR數(shù)值與已發(fā)表的結(jié)果無明顯不同。本研究表明采用微滲透泵技術(shù)，用FITC-菊粉作為標(biāo)記物，可以比較準(zhǔn)確地測(cè)定清醒狀態(tài)下大鼠GFR，尤其是無需收集尿液的方法，實(shí)驗(yàn)更簡(jiǎn)化，易于操作。

致謝感謝劉沛教授對(duì)本研究的指導(dǎo)。感謝中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室李春艷老師在熒光分光光度計(jì)使用方面的指導(dǎo)。感謝中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心楊晨老師在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面的指導(dǎo)。還要感謝本科室同志們對(duì)我科研工作的大力支持。

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