云南獼猴mtDNA控制區全序列測定

禹文海，黃 芬，楊鳳梅，魯帥堯，趙 遠，沈 冬，王俊斌，陳麗雄，和占龍

（1.中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南昆明 650118； 2.昆明理工大學生命科學與技術學院，云南昆明 650224）

線粒體DNA（m tDNA）是細胞核外遺傳物質，呈共價閉合的環狀雙鏈結構，能夠獨立地進行復制和轉錄，其具有母系方式遺傳、堿基變異大、進化速度快等特點。其中，線粒體DNA控制區的進化速度是線粒體DNA其它區域的3～5倍，在生物遺傳進化和種群遺傳變異程度的研究中應用廣泛［1-5］。獼猴又稱恒河猴、廣西猴、黃猴，為靈長目猴科獼猴屬的一個種。云南位于中國的西南方，獼猴資源十分豐富，在北部、西北部、中部、南部和東北部等均有分布［6］。本研究以云南獼猴作為研究對象，測定線粒體控制區全序列，為獼猴的進化分析及開展獼猴遺傳資源保護和合理開發利用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和DNA提取

實驗采集獼猴全血共7份（鎮康縣1份、景東縣1份、鎮沅縣1份、保山市1份、鄧川縣1份、牟定縣1份、寧蒗縣1份），來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所全國醫學靈長類研究中心實驗動物部，實驗動物生產許可證：（滇）SCXK2010—0006。靜脈抽取全血2 m L，EDTA抗凝。采用Axygen DNA提取試劑盒提取基因組DNA，詳細操作步驟見說明書。

1.2 PCR擴增與目的片段測定

參考相關文獻選取引物對［7，8］，上游引物F（5＇-CCTTACCTGAATTGGAAGCGAACC-3＇）和下游引物R（5＇-GGCCAGGACCAAGCCTATTT-3＇），由生工生物工程（上海）有限公司合成。在PCR儀（Bio-Rad C1000）中進行PCR擴增。反應體積為25μL，引物F和R各（20μmol/L）0.5μL，模板DNA 2μL，2× PCR Master M ix 12.5μL，雙蒸H2O 9.5μL。反應條件為95℃6 min，然后94℃1 m in，66℃45 s，72℃1 min，40個循環，最后72℃延伸10 min。用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，參照DNA marker DL2000出現1 450 bp左右條帶的PCR產物進行純化測序，測序由上海杰李生物技術有限公司完成。

1.3 序列分析及系統進化樹構建

每個個體測得的正反鏈序列用DNAStar軟件進行分析拼接，用Clustalx1.8軟件進行序列比對并輔以人工校對，用DNAStar軟件對序列間同源性進行分析，用MEGA4.0軟件分析序列的堿基組成、轉換和顛換。以來源于美國威斯康星州國家靈長類動物研究中心（WRPRC）的獼猴（GenBank No.AY612638）為外群，分別用鄰接法（neighbor-joining，NJ）和最小進化法（minimum-evolution，ME）構建分子系統進化樹。

2 結果

2.1 序列測定與鑒定

經PCR擴增后得到產物大小約為1 450 bp，去除線粒體DNA控制區兩側的序列后，測得云南獼猴線粒體控制區全序列的長度為1 084～1 089 bp，利用BLAST和GenBank中的獼猴線粒體序列進行比較，同源性達到91.5％以上，說明該序列為獼猴m tDNA控制區。本研究測得的云南獼猴線粒體DNA控制區全序列已提交GenBank數據庫，GenBank No.為JF746819（保山）、JF746820（鄧川）、JF746824（景東）、牟定（JF834919）、JF746839（寧蒗）、JF746823（鎮康）和JF746817（鎮沅）。

2.2 序列堿基組成、遺傳變異及同源性分析

線粒體控制區核苷酸序列堿基組成見表1，不同地區獼猴線粒體DNA控制區G+C的含量（42.9％～43.8％）低于A+T的含量（56.2％～57.1％），A堿基含量為29.6％～30.2％，C堿基含量為30.4％～31.4％，T堿基含量為26.5％～27.4％，G堿基含量為12.2％～12.5％。序列遺傳變異包括轉換、顛換、插入和缺失4種形式，經MEGA4.0軟件分析可知序列中的轉換明顯比顛換多，其中T-C轉換多于A-G，A-C和A-T顛換多于CG和T-G，轉換/顛換比值平均為26.1。

表1 不同地區獼猴線粒體DNA控制區核苷酸堿基組成比較Tab.1 Comparison of nucleotides composition in the m tDNA control region of Macaca mulatta from different areas

不同地區獼猴線粒體控制區全序列間差異及同源性見圖1。

圖1 不同地區獼猴線粒體DNA控制區全序列間同源性分析Fig.1 Homology of the m tDNA control region ofMacaca mulatta from different areas

云南不同地區獼猴的同源性為93.2％～99.5％，具有較高的同源性，同源性最高的是鎮沅和景東獼猴，其次是鄧川和寧蒗獼猴，同源性最低的是鄧川和牟定獼猴。與GenBank中參考序列（AY612638）同源性為91.5％～92.4％之間，其中，與鄧川獼猴同源性最高（92.4％），與牟定獼猴同源性最低（91.5％）。

2.3 構建系統進化樹

以美國威斯康星州國家靈長類動物研究中心的獼猴為外群構建NJ樹（圖2-A）和ME樹（圖2-B），各分支上的數值為1000次自舉（Bootstrap）分析得到的支持率。從圖3中可以看出NJ樹和ME樹具有相同的拓撲結構，兩者均表明所分析的獼猴分為兩大分支，來源于美國的獼猴單獨為一支，而云南獼猴聚為一支。云南獼猴分為兩個平行的姐妹分支，保山和牟定獼猴為一支；景東、鎮沅、鄧川、寧蒗和鎮康獼猴聚為另一支。其中，景東和鎮沅以及鄧川和寧蒗獼猴遺傳關系最近。

圖2 基于線粒體DNA控制區構建的NJ（A）和ME（B）系統樹Fig.2 Phylogenetic trees constructed using NJ（A）and ME（B）methodsbased on the comp lete sequences ofm tDNA control region

3 討論

云南獼猴線粒體DNA控制區全長為1 084～1 089 bp，A、T、G和C四種堿基平均含量分別為29.9％、26.9％、12.3％和30.9％，序列表現出了很強的反G偏倚（即G的含量明顯低于其它3種堿基的含量），這與脊椎動物線粒體DNA的G堿基極低現象一致［9-12］。A+T堿基平均含量（56.8％）高于G+C堿基平均含量（43.2％），與其它哺乳動物A、T含量高和G、C含量低的特點相似。序列變異包括了轉換、顛換、插入和缺失四種形式，其中轉換最為常見，轉換與顛換的比值為26.1，明顯大于轉換與顛換比的臨界值2.0［13］，表現出較高的轉換偏愛性，與其他哺乳動物線粒體DNA序列的研究結果是一致的［14，15］，同時也說明云南獼猴線粒體DNA控制區序列突變未達到飽和狀態。

我們采用鄰接法（NJ）和最小進化法（ME）構建系統進化樹，以來源于美國威斯康星州國家靈長類動物研究中心的獼猴為外群，分析不同地區獼猴的遺傳進化關系。系統進化樹顯示云南獼猴聚為一支，而來源于美國的獼猴單獨聚為一支。就云南獼猴而言存在兩個姐妹分支，來自不同地區的獼猴大多按照其來源地分別相對聚在一起，表現出與地理位置一定的對應關系。目前未見報道國內其它地區獼猴線粒體DNA控制區全序列的測定和提交GenBank數據庫，少數研究報道只是測定了其中的部分序列，因此本實驗中沒有與國內其它地區獼猴群體進行比較研究。

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