通光散湯對小鼠哮喘模型氣道高反應性和氣道炎癥的影響

劉 蓉，趙 瑾，陳國勤，張新鳳，陸潔萍，李洪濤

（1.呼吸疾病國家重點實驗室（廣州醫(yī)學院）；2.廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣州 510120）

通光散又名扁藤，為云南地方草藥，性味苦寒，具有清熱解毒，止咳平喘的作用［1-3］。但目前還沒有單味中藥通光散治療哮喘的基礎(chǔ)實驗研究。為開發(fā)我國特有的中草藥資源，我們在建立小鼠哮喘模型的基礎(chǔ)上，利用Buxco小動物肺功能儀等先進的儀器設(shè)備和方法，確定其對哮喘動物模型氣道高反應和氣道炎癥的影響，探討通光散治療哮喘的可能機制，為通光散的開發(fā)應用提供必要的基礎(chǔ)研究。

1 材料和方法

1.1 材料

雞卵白蛋白OVA（Grade V，美國Sigma公司），氫氧化鋁凝膠（美國Sigma公司），低溫離心機（Bec km an，美國），光學顯微鏡及Nikon數(shù)碼攝影一體化系統(tǒng)（Nikon，日本），小動物肺功能儀（Buxco，美國）。

1.2 中藥

通光散，購自昆明福林堂中藥飲片有限公司（生產(chǎn)許可證號：滇Y20050050）。通光散湯：通光散120 g，加水1 000 m L，文火煎至200 m L，每毫升含生藥量約0.6 g。

1.3 實驗動物與模型建立

35只SPF級6周齡雌性BALB/c小鼠，體重16～19 g，合格證號：0082361，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供。小鼠分籠飼養(yǎng)于廣州醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院動物實驗室屏障環(huán)境（許可證號：SYXK（粵） 2008-0093），動物自由進食顆粒飼料和純凈水。小鼠隨機分為正常對照組（NS，n=10）、模型組（Asthma，n=13）和藥物實驗組（Experiment，n= 12）。以O(shè)VA首次致敏為0 d，模型組和藥物組分別于第0、7、14天每只小鼠分別腹腔注射致敏液OVA200μL（0.04％OVA-NS 50μL與150μL液態(tài)鋁混合）；對照組腹腔注射200μL生理鹽水（NS）。第15天后，藥物組每天灌胃給予通光散湯0.72 m L （20 g/kg體重，約合兒童每天用量的10～15倍），對照組和模型組則以與藥物組等量的生理鹽水（NS）灌胃。于第28、29、30天，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后，模型組和藥物組每只小鼠以O(shè)VA（0.4％溶液50μL）滴鼻，利用小鼠自然呼吸將液滴吸入氣道；對照組用等量的NS滴鼻，1次/d。

1.4 氣道反應性的測定

末次激發(fā)48 h后，用小動物肺功能儀無創(chuàng)法測定小鼠的氣道阻力［4，5］，結(jié)果以增強的呼吸間歇（enhanced pause，Penh）表示。首先記錄小鼠氣道阻力的基礎(chǔ)值（Baseline）1 min，隨后測定30μL生理鹽水（NS）和30μL倍增濃度的乙酰甲膽堿（Mch）霧化激發(fā)小鼠氣道后氣道阻力的變化，每次霧化1 m in，記錄3 min。Mch激發(fā)梯度濃度分別為3.12、6.25、12.5、25、50和100 mg/m L。以NS的Penh值為標準值，將各個濃度Mch的Penh與標準值的比值（Penh/NS）作為氣道反應性統(tǒng)計指標。

1.5 肺泡灌洗液（BALF）收集及細胞計數(shù)

小鼠麻醉處死后仰臥位固定，行氣管插管手術(shù)，以0.8 m L PBS緩沖液灌洗肺泡3次，回收率在80％以上。BALF細胞沉淀作涂片，10％中性甲醛溶液固定后HE染色，連續(xù)計數(shù)400個細胞并進行細胞分類，計算各細胞的百分比構(gòu)成。

1.6 肺組織病理學觀察

將左肺上葉分離，10％中性甲醛溶液固定24 h以上，石蠟包埋，切片，HE染色和PAS染色后行肺組織病理觀察。HE染色切片參考Henderson的方法按以下標準半定量評定支氣管/血管周圍炎癥細胞浸潤程度［6，7］：-（0分）：支氣管/血管周圍幾乎無炎癥細胞；+（1分）：支氣管/血管周圍散在少許炎癥細胞；++（2分）：支氣管/血管周圍較多分布不均的炎癥細胞但未聚集成團；+++（3分）：支氣管/血管周圍大量炎癥細胞，分布較均勻，但少見聚集成團；++++（4分）：支氣管/血管周圍大量炎癥細胞聚集成團。

1.7 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，方差齊用最小顯著差異法（LSD），當方差不齊時用Tamhane＇s T2法。在造模過程中死亡及感染的動物不列入統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

OVA激發(fā)前，即28 d之前，三組小鼠狀態(tài)表現(xiàn)正常，體重增加。在第28天用OVA激發(fā)后，模型組和藥物組動物毛色失去光澤，蓬松，從小鼠體重有明顯下降（圖1）。對照組小鼠激發(fā)過程中未出現(xiàn)明顯的上述表現(xiàn)。模型組和藥物組在OVA激發(fā)過程中分別有2只和3只小鼠死亡，主要原因可能是麻醉過深、滴鼻后導致窒息死亡。

圖1 小鼠體重變化曲線Fig.1 Body weight changing curve of the mice

2.2 小鼠氣道阻力（Penh/NS）的變化

小鼠氣道阻力的變化見表1。

2.3 支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞總數(shù)、細胞分類的變化

模型組BALF中細胞總數(shù)和Eos（％）較對照組明顯增加，模型組中Eos（％）接近70％（P＜0.01）（表2）。

2.4 小鼠肺組織病理變化

小鼠肺組織病理變化見圖2（見彩插4）.

3 討論

支氣管哮喘（Asthma，以下簡稱哮喘），又稱氣道變異性炎癥（AAl），是最常見的以氣道高反應性和氣道通氣障礙為特征的慢性呼吸道疾病，被世界醫(yī)學界公認為四大頑癥之一［7］。目前哮喘的防治均采用局部療法，應用包括糖皮質(zhì)激素在內(nèi)的抗炎藥物。但是由于激素的副作用，使其在應用上受到限制，特別對于兒童病人。通光散（Marsdenia tenacissima）是蘿藦科牛奶菜屬植物［1］，廣泛分布于亞洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)，包括我國的云南、貴州等地。其活性成分不僅具有抗癌的作用，而且具有平喘作用［10］。據(jù)《云南抗癌中草藥》記載［2］：通光散別名烏骨藤，具有味苦，清熱、解毒、止咳平喘、散結(jié)止痛的作用。《廣西藥用植物名錄》通光藤莖止咳，祛痰，平喘，用于慢性支氣管炎［3］。通光散價格便宜，購買也很方便。長期以來作為主藥用于哮喘病人的治療［9］。但是缺少臨床前的基礎(chǔ)研究特別是藥效學的研究。本實驗首先建立小鼠哮喘模型，利用Buxco小動物肺功能儀對哮喘動物模型氣道高反應測定，同時結(jié)合病例分析，觀察其對小鼠模型氣道炎癥的影響。結(jié)果表明：與對照組比較，哮喘模型動物具備氣道高反應性；小鼠哮喘模型BALF中白細胞較對照組明顯增多，Eos的比例接近70％，支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤，肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見嗜酸細胞浸潤，氣道分泌大量黏液，說明哮喘模型的建立是成功的。雖然BALF總數(shù)與其他報道略有不同，原因可能與方法不同有關(guān)，但不影響對結(jié)果的判斷。實驗組的結(jié)果與模型組有明顯差異，與對照組接近，說明TGS對于抑制哮喘氣道高反應性和氣道炎癥的效果是十分明顯的。

表1 小鼠經(jīng)乙酰甲膽堿（Mch）激發(fā)后氣道阻力（Penh/NS）的變化Tab.1 Changes of airway resistance（Penh/NS）in mice after Mch stimulation in the three groups（±s）

表1 小鼠經(jīng)乙酰甲膽堿（Mch）激發(fā)后氣道阻力（Penh/NS）的變化Tab.1 Changes of airway resistance（Penh/NS）in mice after Mch stimulation in the three groups（±s）

＊P＜0.05 vs.asthma group.

組別Group乙酰甲膽堿Mch（mg/mL） 3.12 6.25 12.5 25 50 100正常對照組Normal 1.12±0.12 1.35±0.22* 1.73±0.31* 3.45±0.61* 4.57±0.45* 5.23±1.21*哮喘模型組Asthma 1.31±0.31 2.06±0.63 3.24±0.7 4.69±0.27 6.58±0.79 8.53±1.1藥物治療組Experiment 1.29±0.23 1.46±0.31* 2.18±0.44* 3.32±0.49* 4.83±0.66* 5.57±0.66*

表2 三組BALF細胞總數(shù)及細胞分類的變化Tab.2 The total cell numbers and types of BALF in mice of the three groups（±s）

表2 三組BALF細胞總數(shù)及細胞分類的變化Tab.2 The total cell numbers and types of BALF in mice of the three groups（±s）

P＜0.05 vs.asthma group.

組別Groups BALF細胞總數(shù)The total cells of BALF嗜酸粒細胞Eos單核細胞Mac淋巴細胞Lym粒細胞Neu （×104/m L）（％）（％）（％）（％）正常對照組NS 3.21±2.58* 0.08±0.15* 70.88±18.82* 10.52±12.79* 17.85±19.46*哮喘模型組Asthma 14.59±8.60 69.22±7.87 24.00±7.91 2.67±1.48 4.11±1.87藥物治療組Experiment 5.32±2.02* 2.12±0.18* 61.81±20.52* 15.98±12.67* 20.09±19.85*＊

嗜酸性粒細胞是支氣管哮喘發(fā)病的主要效應細胞，能釋放炎癥介質(zhì)及炎癥蛋白顆粒，引起氣道高反應性及炎癥反應。本實驗觀察到哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒細胞的百分比明顯升高，肺病理切片也可見細支氣管壁黏膜水腫、增厚，肺泡及細支氣管中有大量炎性細胞浸潤，嗜酸性粒細胞可產(chǎn)生多種細胞因子和炎性介質(zhì)，引起氣道上皮損傷和氣道高反應性。其釋放的氧化產(chǎn)物可破壞肺周圍組織的完整性。嗜酸性粒細胞釋放的炎性介質(zhì)又可促進單核細胞、淋巴細胞及嗜酸性粒細胞本身的募集作用［8］，中藥TGS可明顯減少嗜酸性粒細胞的滲出，本實驗數(shù)據(jù)顯示，給藥TGS后，BALF中EOS數(shù)目可明顯減少，肺組織病理學觀察可見肺部炎癥減輕，表明TGS具有抗氣道炎癥作用，由此可推斷TGS平喘機制之一可能與抑制炎癥細胞的滲出有關(guān)。

本研究建立的小鼠哮喘模型，符合哮喘發(fā)作期可逆性氣流受限及氣道高反應典型特征。實驗觀察到通光散湯可顯著抑制哮喘小鼠氣道高反應性，改善肺功能，具有抗哮喘作用。

（致謝：感謝張秀蘭醫(yī)生的支持和幫助!）

［1］全國中草藥匯編編寫組.全國中草藥匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社.1978：441.

［2］胡月英，宣明盛.云南抗癌中草藥［M］.昆明：云南人民出版社.1982：68-69.

［3］廣西壯族白治區(qū)中醫(yī)藥研究所.廣西藥用植物名錄［M］.南寧：廣西人民出版社.1986：377.

［4］何勝東，賴克方，姚衛(wèi)民，等.小鼠哮喘模型氣道反應性檢測方法的建立［J］.廣東醫(yī)學，2006，27（11）：1659-1661.

［5］姜華，賴克方，沈璐，等.卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）對哮喘小鼠氣道炎癥和氣道反應性的影響［J］.國際呼吸雜志，2010，4（30）：409-413.

［6］Ohki Y，Tokuyama K，Mayuzumi H，et al.Characteristic features of allergic airway inflammation in a murine model of infantile asthma［J］.Int Arch Allergy Immunol.2005.138 （1）：51-58.

［7］Mayuzumi H，Ohki Y，Tokuyama K，et al.Age-related difference in the persistency of allergic airway inflammation and bronchial hyperresponsiveness in a murine model of asthma［J］.Int Arch Allergy Immunol.2007，143（4）：255-262

［8］Glaab T，Daser A，Braun A，et al.Tidalmidexpiratory flow as a measure of airway hyperresponsiveness in allergic mice［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280（3）：L565 -L573.

［9］阮江華，張秀蘭，尹淑麗，等.通光散湯治療小兒哮喘53例［J］.新中醫(yī)，2003，35（6）：60-61.

［10］李延芳，廖文斌，馬麗芳，等.通光散化學成分和藥理活性的研究進展［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18（7）：1761-1763.