甲型H1N1流感病毒感染不同免疫缺陷小鼠的比較

劉 穎，鄧 巍，徐艷峰，朱 華，馬春梅，李楓棣，鮑琳琳，秦 川

（中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室；中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室）

流感病毒的全球流行往往導致嚴重的后果，1918年的西班牙流感最終致使5 000萬人死亡，而2009年爆發的甲型H1N1流感病毒的大流行迅速蔓延傳播至世界兩百多個國家和地區，造成數萬人死亡。流感病毒感染宿主后，針對病原體的適應性免疫在病毒的清除中起到關鍵作用，并據此設計出多種流感疫苗應。近來隨著對非特異性的固有免疫的研究不斷深入，發現包括NK細胞、肺泡巨噬細胞和DC等在控制病毒復制和調節病毒特異的適應性免疫中都起到重要的作用。缺少T細胞、B細胞和NK細胞的小鼠不能抵御病毒感染但能夠通過給予特異性抗體進行治療，而T細胞和B細胞重排缺陷的小鼠感染后始終不能清除病毒，體重持續下降直到死亡。本研究中使用了四種不同的免疫缺陷型小鼠建立甲型H1N1流感病毒感染模型，比較了其在感染病毒后動物的存活率、體重減少情況和肺組織病變上與野生型小鼠的差異。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性4～6周C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠、SCID小鼠、NOD/LtJ小鼠、BALB/c-nu小鼠和NODSCID小鼠（各10只）（由北京華阜康提供SCXK2009-0004）。小鼠按品系分籠飼養，實驗前3 d安置于ABSL-3實驗室獨立送風隔離籠具中適應環境。

1.2 病毒感染

H1N1病毒A/California/7/2009（CA7）株，以106TCID50。各品系小鼠經乙醚麻醉后進行滴鼻攻毒，每只小鼠50μL，攻毒后每天觀察，分別于第4天、第7天和第14天處死小鼠取材檢測小鼠感染后的肺組織病毒載量和病理改變。實驗在中國醫學科學院實驗動物研究所ABSL-3實驗室中進行。

1.3 動物犧牲及標本處理

斷頸處死小鼠，打開胸腔，保留肺組織：取右上肺葉于組織裂解液中用于提取組織RNA；取右中肺葉于凍存管置-80℃冰箱中備份保存；其余肺葉于10％中性甲醛溶液中固定。

1.4 肺組織總RNA提取及PCR檢測

RNeasy Mini Kit試劑盒（Qiagen，74106）提取肺組織總RNA，反轉錄成cDNA。使用熒光染料Power SYBR Green PCR Master Mix（ABI，4367659）進行real-time PCR檢測（ABI Stepone PCR儀）。擴增程序94℃3 min；94℃30 s，59℃30 s，72℃30 s，共35個循環；95℃，15 s；60℃1 min；95℃15 s。每次試驗的標準品作106copies/m L、105copies/m L、104copies/m L、103copies/m L、102copies/m L濃度梯度稀釋，陰性對照（H2O）與樣品一起提取RNA后做realtime PCR。通過讀取儀器數據得到病毒載量。所用H1N1亞型特異性引物為 SW-H1 F786 5’-AATAACATTAGAAGCAACTGG-3’，SW-H1 R920 5’-AGGCTGGTGTTTATRGCACC-3’，目的片段大小為153 bp［1］。

1.5 病理學檢查

取小鼠肺組織，10％中性甲醛溶液固定，常規石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察其病理變化。

1.6 統計學方法

小鼠的體重變化用體重百分比表示，即以小鼠當天體重減去0 d體重的差值作分子，以0 d體重做分母，記錄為平均體重變化±標準差，數值采用每組的平均數。各組小鼠肺組織病變面積使用單因素方差分析進行兩兩比較。

2 結果

2.1 小鼠感染后存活情況和大體觀察

各組小鼠感染H1N1病毒后逐漸出現進食減少、消瘦、被毛逆立、弓背、反應遲鈍等癥狀。感染H1N1病毒的6種小鼠在觀察的14 d內，僅有野生型的C57BL/6小鼠有50％存活，BALB/c小鼠和各免疫缺陷品系的小鼠死亡率均為100％。其中，NK細胞缺陷的NOD/LtJ小鼠感染早期即開始大量死亡，至感染后第8天已經沒有存活小鼠；T細胞缺陷的BALB/c-nu小鼠在中晚期大量死亡，至感染后第11天全部死亡；而T細胞和B細胞缺陷的SCID和T、B、NK細胞聯合缺陷的NOD-SCID小鼠分別于感染后第3天和第4天開始出現死亡，至感染后第13天和第12天全部死亡（圖1）。剖檢過程中可見感染小鼠肺臟有明顯的充血和水腫，肺組織表面有局部實變，其他臟器未見明顯改變。

圖1 不同品系小鼠感染H1N1流感病毒存活率Fig.1 Survival rate of differentmouse strains infected with influenza A（H1N1）virus

2.2 小鼠體重變化

C57BL/6小鼠體重下降緩慢，只（7～10）d降至最低，約為實驗前的80％～90％，而后存活小鼠體重逐漸回升；其余品系小鼠體重隨病情發展快速下降，直至死亡，其中SCID小鼠體重下降最快，10 d降至感染前體重的60％以下，BALB/c小鼠、NOD/ LtJ、BALB/c-nu和NOD-SCID小鼠體重下降較快，（7～10）d降至感染前體重的60％～70％（圖2）。

圖2 不同品系小鼠感染H1N1流感病毒后體重變化情況Fig.2 Different laboratory mouse strains exhibit variablekinetics of weight loss after influenza A（H1N1）virus infection

2.3 小鼠肺組織病毒載量檢測結果

攻毒后4 d和7 d處死小鼠取肺組織RT-PCR檢測流感病毒的表達量（表1），各組小鼠均染毒。攻毒后4 d C57BL/6小鼠病毒載量較小，其余各品系小鼠病毒載量較大，將各組小鼠病毒拷貝數取對數后進行方差分析，各品系小鼠間差異沒有顯著性。

表1 H1N1感染小鼠肺組織病毒拷貝數Tab.1 Virus copy number ofm ice infected with H1N1 virus

2.4 小鼠肺組織病理觀察結果

感染H1N1流感病毒后，各品系小鼠肺組織均出現了一定程度的損傷，其中BALB/c-nu小鼠的損傷面積最小，SCID小鼠的損傷面積最大，但統計學上差異沒有顯著性（圖3）；C57BL/6小鼠和NOD/ LtJ小鼠7 d的病變面積較4 d有所局限縮小，BALB/c小鼠、SCID小鼠、BALB/c-nu小鼠和NODSCID小鼠7 d的病變面積較4 d略有擴大，但均沒有統計學意義。

圖3 不同品系小鼠感染H1N1流感病毒后肺組織損傷面積比例Fig.3 Percentage of lung lesion area in different laboratory mouse strains after infection with influenza A（H1N1）virus

除肺組織損傷的病變面積不同外，各品系小鼠肺組織的病變特點也不盡相同。從肺組織病理改變看，C57BL/6小鼠感染初期表現為較彌漫的間質性肺炎，血管擴張充血，周圍水腫，有單核細胞、淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，細支氣管上皮較完整，肺泡間隔增寬，肺泡受壓變形，腔內有炎細胞；感染后期病變逐漸局限，細支氣管上皮細胞出現增生，滲出的炎細胞逐漸減少。與野生型C57BL/6小鼠相比，BALB/c小鼠和其余四種免疫缺陷型小鼠感染后病變隨病程進展不斷加重，沒有恢復好轉，這與存活情況和體重減少的結果相一致。除了出現間質性肺炎和血管變化外，由于缺乏清除病毒的免疫機制，免疫缺陷小鼠細支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞出現了變性壞死和脫落，SCID小鼠和NOD/ LtJ小鼠感染后7 d和NOD-SCID小鼠感染后4 d和7 d表現尤為嚴重。與C57BL/6小鼠肺組織內多種炎癥細胞的浸潤參與炎癥反應對抗病毒感染不同，免疫缺陷小鼠的肺組織內炎細胞數量很少，SCID小鼠以中性粒細胞和巨噬細胞為主，NOD/LtJ小鼠以中性粒細胞和單核細胞為主，BALB/c-nu小鼠以中性粒細胞為主，NOD-SCID小鼠僅有少量的單核細胞和巨噬細胞（圖4，見彩插1）。

3 討論

在流感病毒的初次感染中，固有免疫和適應性免疫在病毒的清除和病變的局限中都起著重要的作用。我們使用甲型H1N1病毒A/California/7/ 2009（CA7）株感染野生型和4種免疫缺陷型小鼠，觀察各品系小鼠病毒感染和肺組織的病理改變。結果發現不同品系的小鼠感染流感病毒，由于宿主本身的免疫系統功能狀態不同，所以對病毒的反應存在差異。

從動物死亡情況看，野生型的C57BL/6小鼠的存活率最高，為50％；BALB/c小鼠和各免疫缺陷品系的小鼠死亡率均為100％。其中，NK細胞缺陷的NOD/LtJ小鼠感染早期即開始大量死亡；T細胞缺陷的BALB/c-nu小鼠在中晚期大量死亡。從動物體重減低的情況看，C57BL/6小鼠感染后體重下降后又回升；BALB/c小鼠和各免疫缺陷品系小鼠感染病毒后體重隨病情發展快速下降，直至死亡。這說明在病毒感染早期，NK細胞起到重要的清除病毒的作用，NK細胞缺陷的小鼠感染流感病毒后很快出現死亡；而在感染晚期主要由特異性的T細胞清除病毒，T細胞缺陷小鼠在感染中晚期大量死亡。NK細胞被認為不僅在對抗病毒感染的固有免疫過程中發揮作用，同時在調節病毒特異的適應性免疫中也起到重要作用。然而之前的研究也發現，雖然NK細胞在病毒感染早期的固有免疫中有重要的作用，但流感病毒發展出逃避固有免疫的能力［2，3］，病毒能夠降低NK細胞的活性［4］。而且除了NK細胞，固有免疫還有DC、巨噬細胞、中性粒細胞等多種細胞和組分參與作用，所以BALB/c小鼠與NOD/ LtJ小鼠，SCID小鼠與NOD-SCID小鼠間在死亡率上并沒有明顯的差異。這些結果說明在甲型H1N1流感感染的過程中NK細胞的缺陷影響到感染早期動物的存活，但對整個發病的預后并沒有起到決定性的影響。T、B細胞聯合缺陷的SCID小鼠較T細胞單獨缺陷的小鼠更早出現死亡，體重下降也更為明顯，說明B細胞在流感病毒的感染中起到至關重要的作用。之前也有研究表明流感的初次感染中，單獨B細胞缺陷的小鼠和同時缺乏B細胞和CD8+T細胞的小鼠均不能抵抗病毒的感染，前者盡管也有大量的CD8+T細胞浸潤但仍然不能抵抗病毒的感染。但單獨CD4+T細胞缺陷的小鼠卻僅僅引起病毒清除的延遲，但仍能存活下來［5］，所以在T細胞對抗流感病毒的過程中，CD8+T細胞的作用可能占主導作用。

從肺組織病理改變看，C57BL/6小鼠感染由彌漫的間質性肺炎逐漸局限；BALB/c小鼠和其余四種免疫缺陷型小鼠感染后病變隨病程進展不斷加重，沒有恢復好轉，這與存活情況和體重減少的結果相一致。除了出現間質性肺炎和血管變化外，由于缺乏清除病毒的免疫機制，免疫缺陷小鼠細支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞出現了變性壞死和脫落。但由于各品系小鼠的免疫系統表型的差異，肺組織中浸潤的炎細胞種類也有差異，但除了相應的淋巴細胞數量減少外，其他組分的炎癥細胞由于缺乏相應的刺激和誘導因子，對流感病毒感染的反應也有所降低，參與炎癥反應的數量減少。由此可知流感病毒感染中，NK細胞、T細胞和B細胞除了直接的病毒殺傷作用和抗體中和作用外，對其他炎癥細胞的活化和誘導也起著重要的作用。但BALB/c小鼠雖然免疫系統沒有顯著缺陷，但肺組織內的炎癥細胞數量明顯少于C57BL/6小鼠肺組織內炎癥細胞數量，造成這一現象的具體機制還有待于進一步研究。

［1］鮑琳琳，孫惠惠，占玲俊，等.A/California/7/2009與A/ California/4/2009病毒感染力比較［J］.中國比較醫學雜志，2010，20（1）：6-9.

［2］Heltzer，ML，Coffin SE，Maurer K，et al.Immune dysregulation in severe influenza［J］.J Leukoc Biol.2009.85：1036-1043.

［3］Gobbo D，Villani N，Marini S，et al.Suppressor cells induced by influenza virus inhibit interleukin-2 production in mice［J］.Immunology 1990.69：454-459.

［4］Mao HW，Tu WW，Liu YP，et al.Inhibition of human natural killer cell activity by influenza virions and hemagglutinin［J］.J Virol，2010，（5）：4148-4157.

［5］Wu HY，Haist V，BaumgartnerW，et al.Sustained viral load and late death in Rag2-/-mice after influenza A virus infection［J］.Virol J，2010，7：172，doi：10.1186/1743-422X-7-172.