注射用阿洛西林鈉無菌檢查方法驗證實驗

陳慧 邱旭

注射用阿洛西林鈉無菌檢查方法驗證實驗

陳慧 邱旭

目的建立健全注射用阿洛西林鈉無菌檢查方法,保證檢驗結果的準確性和可靠性。方法按中國藥典 2010年版二部(附錄ⅪH)無菌檢查法中的薄膜過濾法進行。結果采用薄膜過濾法以 500ml/管緩沖液沖洗量檢查,阿洛西林鈉對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除。結論注射用阿洛西林鈉采用薄膜過濾法進行無菌檢查時,緩沖液沖洗量以 500ml為宜,金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌均可作為陽性對照菌。該方法可作為注射用阿洛西林鈉的常規無菌檢查方法。

注射用阿洛西林鈉;無菌檢查法;方法學驗證

阿西洛林鈉是青霉素類抗生素,第三代廣譜半合成青霉素,對G+菌、G-菌及厭氧菌有效,能強烈地對抗綠膿桿菌。臨床應用于 G+菌、G-菌及厭氧菌引起的感染。本實驗采用中國藥典 2010年版無菌檢查中的薄膜過濾法,探尋注射用阿洛西林鈉無菌檢查時適宜的檢驗方法。

1 試驗環境與材料

1.1 試驗環境 在環境潔凈度萬級、局部潔凈度百級的單向流空氣的菌無室中進行。

1.2 儀器 智能集菌儀(杭州泰林生物技術設備有限公司)、PY 330一次性全封閉集菌培養器(杭州泰林生物技術設備有限公司)、生化培養箱(蘇州威爾實驗用品有限公司)、霉菌培養箱(蘇州威爾實驗用品有限公司)、生物安全柜(蘇州安泰空氣技術公司)

1.3 試藥 注射用阿洛西林鈉(華北制藥股份有限公司、規格 1.5g、批號:F1003603)

1.4 試驗用菌株 金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]。

1.5 培養基、稀釋液及緩沖液

1.5.1 干粉培養基 硫乙醇酸鹽流體培養基(批號:100318)、改良馬丁培養基(批號:091019)、營養瓊脂培養基(091221)、瓊脂粉(000817),均由北京三藥科技開發公司生產。

1.5.2 細菌稀釋液 0.9%滅菌氯化鈉溶液(批號:2010041103)由洛陽市秦嶺制藥有限責任公司生產。

1.5.3 沖洗用緩沖液 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:20110305),由三門峽市食品藥品檢驗所藥理室配置。

2 方法與結果

2.1 菌液制備 按中國藥典 2010年版附錄ⅪH無菌檢查法菌液制備方法制備[1]。

2.2 菌落計數 取金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液各1m l分別接種于營養瓊脂培養基中,生孢梭菌接種至含 1.5%瓊脂的硫乙醇酸鹽流體培養基中,經30℃～35℃生化培養箱培養 24～48h,取白色念珠菌菌液、黑曲霉菌液各 1m l分別接種至改良馬丁瓊脂培養基中,經23℃～28℃霉菌培養箱培養 48～72h,計數。結果見表1。(上述各菌液分別接種兩個平板,取平均值,同時設陰性對照)

表1 驗證用菌液的稀釋級及菌落數

2.2 方法學驗證

2.3.1 試驗組(樣品 +陽性) 取一次性全封閉集菌培養器(三聯裝)一套,先用少量 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜,取樣品 15瓶溶解于 250m l緩沖液中,按薄膜過濾法過濾,樣品過濾完畢后,再用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗,每次每管注入沖洗液 100ml,充分振搖,完全排空后循環操作 3次,總沖洗量達到 300ml每管。沖洗完畢后在2管中分別注入改良馬丁培養基 100ml,另 1管中注入硫乙醇酸鹽流體培養基 100m l。另取一套集菌培養器(三聯裝)取本品依上述方法過濾并沖洗后,均注入硫乙醇酸鹽流體培養基 100ml,將上述 6管集菌培養器移至陽性對照室,于含硫乙醇酸鹽流體培養基的集菌培養器中,分別接種金黃色葡萄球菌菌液、大腸埃希菌菌液、枯草芽孢桿菌菌液、生孢梭菌菌液各 1ml,于含改良馬丁培養基的集菌培養器中,分別接種白色念珠菌菌液和黑曲霉菌液各 1m l,按前述規定溫度培養 3～5d,觀察結果(見表2)。

2.3.2 陽性對照組 取一次性全封閉集菌培養器(三聯裝)二套,4管中分別注入硫乙醇酸鹽流體培養基各 100ml、2管中分別注入改良馬丁培養基各 100ml,在陽性對照室內將 6種菌液分別接種至相應管內,作為陽性對照,按前述規定溫度培養 3～5d,觀察結果(見表2)。

2.3.3 陰性對照組 取一次性全封閉集菌培養器(二聯裝)一套,濾過適量緩沖液后分別注入硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基各 100ml,作為陰性對照,按前述規定溫度培養 14d,觀察結果(見表2)。

表2 方法學驗證結果統計表

以上 3組平行試驗結果表明,本品在該檢驗量下用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液以 300ml/管的沖洗量沖洗,枯草芽孢桿菌、生孢梭菌、白色念珠菌及黑曲霉管中僅需2d就發現有菌生長,而金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌管中 4d后才發現有菌生長,說明在該沖洗量下上述 2種菌的抑菌活性尚不能完全消除。因此將沖洗量增加為 500ml/管、800m l/管,同法操作,驗證結果(見表3)。

表3 方法學驗證結果統計表

綜合表3結果可以看出,在沖洗量為 500ml/管的條件下,對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌的抑菌活性已完全消除,在沖洗量為 800ml/管的條件下,濾膜由輕微的破裂,導致試驗失敗,無法統計結果。

由此可以得出,本品采用薄膜過濾法進行無菌檢查時,緩沖液的沖洗量以 500ml為最佳選擇。

2.3.4 樣品的無菌檢查 取樣品 15支依上述方法同法操作,以 500ml/管的沖洗量沖洗,加入培養基后,按規定溫度培養 14d,逐日觀察,樣品組 2管均澄清;陽性對照管培養 2d后,菌落生長良好;陰性對照管培養 14d均澄清;由此判定供試品符合規定。

3 討論

目前,抗生素類藥物的應用非常廣泛,針對每種抗生素類藥物建立嚴格的質量標準,提高抗生素的質量就顯得尤為關鍵。所以對一個新品種建立無菌檢查法時,對其方法進行驗證就顯得尤為必要。薄膜過濾法作為無菌檢查中的一種方法,具有準確、方便、快捷的優點,是無菌檢查時所采用的一種重要方法。

試驗表明上述方法操作方便快捷、結果準確。所以,該無菌檢查方法驗證對保證結果的可信度和準確性具有重要意義。

[1] 中國藥典委員會.中國藥典 2010年版.二部.北京:中國醫藥科技出版社,2010.

450002三門峽市食品藥品檢驗所