規(guī)?；i場(chǎng)豬鏈球菌的分離與鑒定

胡一飛 金俊杰 鄭潤(rùn)俊 金大春

（1浙江省瑞安市畜牧獸醫(yī)局，浙江省瑞安市 325200；2溫州市畜牧獸醫(yī)局，浙江省溫州市 325000；3瑞安市畜牧獸醫(yī)局市區(qū)動(dòng)物防疫所，浙江省瑞安市 325200）

規(guī)?；i場(chǎng)豬鏈球菌的分離與鑒定

胡一飛1金俊杰2鄭潤(rùn)俊3金大春2

（1浙江省瑞安市畜牧獸醫(yī)局，浙江省瑞安市 325200；2溫州市畜牧獸醫(yī)局，浙江省溫州市 325000；3瑞安市畜牧獸醫(yī)局市區(qū)動(dòng)物防疫所，浙江省瑞安市 325200）

豬鏈球菌病是由多種不同群、不同血清型的鏈球菌引起的不同臨床癥狀的傳染病的總稱。因該致病菌有多達(dá)11個(gè)血清群致病，有限幾個(gè)血清群 （型）的疫苗，對(duì)此病的預(yù)防根本無濟(jì)于事。加上該病的耐藥性強(qiáng)，耐藥譜廣，抗生素治療經(jīng)常無效。當(dāng)暴發(fā)此病時(shí)，常常無計(jì)可施，且其特征性癥狀主要以高熱和敗血癥為主，給人以高熱病的假象。一些專家認(rèn)為鏈球菌對(duì)當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的危害已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重，并且很可能是近幾年愈演愈烈的無名高熱綜合征的主要病原[1]。本試驗(yàn)通過對(duì)瑞安市規(guī)?；i場(chǎng)進(jìn)行豬鏈球菌的分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)，為預(yù)防和控制該病的流行提供了重要依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病料來源

病料取自2007年9月至2010年5月在本市發(fā)生豬高熱病的7家畜牧場(chǎng)的發(fā)病豬。

1.1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)基

普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基、普通液體培養(yǎng)基。

1.1.3 試驗(yàn)用品

細(xì)菌鑒定用的微量生化管、藥敏紙片、革蘭氏染色液、無菌綿羊血購(gòu)自杭州天和微生物有限公司；試驗(yàn)用的化學(xué)試劑購(gòu)自化工市場(chǎng)，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)小鼠和試驗(yàn)兔

實(shí)驗(yàn)用的小鼠和兔子購(gòu)自溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為清潔級(jí)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離純化

用接種針無菌取病豬心血、肝、肺組織分別接種到綿羊全血平板和普通固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，從平板上挑取單菌落再次進(jìn)行純培養(yǎng)。

1.2.2細(xì)菌鑒定

對(duì)需進(jìn)一步鑒定的純培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行涂片染色鏡檢，觀察其形態(tài)、大小及染色特性，移植于綿羊全血平板和普通固體培養(yǎng)基，進(jìn)行生長(zhǎng)觀察，并進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3生化試驗(yàn)

用微量生化試驗(yàn)管，按說明書操作進(jìn)行生化試驗(yàn)[2]。

1.2.4藥敏試驗(yàn)

將分離鑒定好的菌株接種于綿羊全血平板，涂勻，選取相應(yīng)抗生素的藥敏紙片貼于培養(yǎng)基上。于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，測(cè)量抑菌環(huán)直徑并判定結(jié)果。

1.2.5動(dòng)物試驗(yàn)

用分離的鏈球菌過夜培養(yǎng)液分別接種兔子 （耳靜脈注射1.5 mL+皮下分四點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.5 mL），觀察其表現(xiàn)并測(cè)量體溫，記錄并連續(xù)觀察7天；用分離的鏈球菌過夜培養(yǎng)物分別接種小白鼠，每只0.2 mL腹腔注射，觀察其表現(xiàn)情況和死亡情況，記錄并連續(xù)觀察7天。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

對(duì)多個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)送檢的病死豬樣品進(jìn)行細(xì)菌學(xué)化驗(yàn)，基本上每個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)都分離到細(xì)菌，某些豬場(chǎng)首次送檢樣品時(shí)由于采樣前大劑量使用過抗生素而未分離到細(xì)菌，經(jīng)重新采樣，從流產(chǎn)、死產(chǎn)胎兒、新生仔豬或未使用過抗生素的患病個(gè)體采集，均成功分離出致病菌。

2.2 細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

對(duì)13株分離菌進(jìn)行鮮血瓊脂平板培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后，共有10個(gè)菌株在鮮血瓊脂平板上形成表面光滑、灰白色、針尖大小、圓形、半透明、隆起的小菌落，并呈現(xiàn)草綠色溶血。單個(gè)菌落涂片染色后經(jīng)革蘭氏染色，普通光學(xué)顯微鏡下鏡檢，可見革蘭氏染色陽性、呈長(zhǎng)鏈狀的球菌。其余3株菌落形態(tài)、溶血特征及單個(gè)菌落涂片染色鏡檢等不符合以上特征 （2株能在麥康凱平板生長(zhǎng)的，一株為大腸桿菌、一株為沙門氏菌，另外一株鏡檢為葡萄球菌）。具體見表1。

2.3生化鑒定結(jié)果

對(duì)上述10株分離純化后的細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，10株均符合豬鏈球菌的生化培養(yǎng)特性 （見表2），說明分離10株細(xì)菌為豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

從藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果看，對(duì)大部分豬鏈球菌高度敏感的藥物有頭孢噻呋、頭孢噻肟等新藥；環(huán)丙沙星、先鋒V、頭孢拉定、新霉素、阿莫西林、氟苯尼考等為中敏藥物；林可霉素、壯觀霉素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、丁胺卡那等為低敏藥物，而牧場(chǎng)中最常用的青霉素G、鏈霉素、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素、紅霉素、痢特靈等對(duì)大部分豬鏈球菌無效。

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1兔子攻毒結(jié)果

用分離鏈球菌過夜培養(yǎng)液 （耳靜脈1.5 mL注射+皮下分四點(diǎn)注射，每點(diǎn)0.5 mL）接種10只兔子，接種后2小時(shí)內(nèi)體溫逐漸上升，并超過1℃以上，維持2小時(shí)左右，以后一直緩慢下降，均于24小時(shí)內(nèi)死亡。其中呼吸癥狀逐漸明顯，耳靜脈充血明顯。對(duì)死亡的兔子剖檢，病理變化幾乎相似，表現(xiàn)為：肺水腫，肺上有出血斑，肝腫大、腎有出血點(diǎn)，病料中均可分離到鏈球菌。

2.5.2小白鼠攻毒結(jié)果

鏈球菌過夜培養(yǎng)液接種小白鼠進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，接種20只小鼠，每只小鼠腹腔注射培養(yǎng)物0.2 mL過夜，4小時(shí)后，扎堆、嗜睡較嚴(yán)重，并出現(xiàn)弓背、對(duì)外界反應(yīng)遲鈍、呼吸急促、食欲減退、飲欲增加，24個(gè)小時(shí)內(nèi)，有10只死亡，兩只瀕臨死亡。48小時(shí)全部死亡。對(duì)死亡的小白鼠剖檢，病理變化幾乎相似，表現(xiàn)為：肺水腫，肺上有出血，肝腫大。從死亡小鼠均可分離到鏈球菌。

3 討論

本次試驗(yàn)從7家豬場(chǎng)分離到的13株細(xì)菌中，其中10株豬鏈球菌、1株葡萄球菌，1株沙門氏菌，1株大腸桿菌；說明鏈球菌是這些豬場(chǎng)細(xì)菌性疾病的主要病原之一。

通過本次的藥敏試驗(yàn)可以看出，目前一般使用較少的頭孢類抗生素對(duì)豬鏈球菌病的控制和預(yù)防有一定的效果，而目前豬場(chǎng)經(jīng)常使用的藥物效果較差。因此建議豬場(chǎng)盡量根據(jù)本場(chǎng)情況，選擇合適藥物進(jìn)行治療和預(yù)防。同時(shí)盡量輪換使用藥物，對(duì)低敏感的藥物直接停用半年以上。

經(jīng)過動(dòng)物試驗(yàn)明顯可以看出，此次分離的鏈球菌致病性較強(qiáng)，可以引起試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生持續(xù)高溫，并造成肺、肝、腎等多臟器出血、衰竭，這不僅是導(dǎo)致發(fā)生豬高熱病以后，出現(xiàn)高熱不退，多器官衰竭的主要原因，而且鏈球菌對(duì)林可霉素、壯觀霉素、強(qiáng)力霉素、復(fù)方新諾明、丁胺卡那等藥物具有很強(qiáng)的耐藥性，導(dǎo)致開始運(yùn)用抗生素治療效果差。

[1]冷和平， 曾俊霞， 溫育銘， 李奎.七個(gè)豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒2型感染并發(fā)副豬嗜血桿菌病和鏈球菌病的綜合防治.豬業(yè)科學(xué)，2008（10）：80-83.

[2]姚火春.獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo) （第二版）.北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版杜，2002.114-118.