1株多重耐藥性鴿源大腸桿菌的分離與鑒定

張彬彬 邵慧君 王彥紅 劉文博（揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇揚州） 225009

1株多重耐藥性鴿源大腸桿菌的分離與鑒定

張彬彬 邵慧君 王彥紅 劉文博（揚州大學獸醫(yī)學院 江蘇揚州） 225009

大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)感染包括急性敗血癥、肉芽腫、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎、臍炎、腦炎、氣囊病以及其他部分或全部由大腸桿菌引起的疾病[1，2]。經研究表明本病在世界各地均有發(fā)生，50%以上的菌株有多重耐藥性，該病是比較常見的人畜共患病，但是往往被人們所忽視[3]。鴿的大腸桿菌病也是鴿子養(yǎng)殖過程中常見的細菌病，并且鴿是大腸桿菌的一個天然儲存宿主[1]。本病一年四季均可發(fā)生，尤以冬季和夏季最為常見，病鴿是造成該病最主要的傳染源。大腸桿菌易產生耐藥性[2]，在選藥治療時存在一定的盲目性。筆者在臨床上分離了1株鴿大腸桿菌，并測定了其對16種抗菌藥的敏感性。

1 材料與方法

1.1 病料來源

無錫某養(yǎng)殖場共飼養(yǎng)了1000羽1年齡期的美國王鴿，正常免疫接種鴿瘟疫苗與禽流感疫苗，2010年7月鴿突然死亡，每天5～10只，部分鴿采食量下降，慶大霉素及丁胺卡那霉素（阿米卡星）飲水不見好轉，持續(xù)10天，遂送5只病死鴿來我院診斷。病理解剖后發(fā)現(xiàn)死亡的鴿腎臟充血，部分有蒼白色壞死點；肝臟腫大充血，部分呈土黃色；胰臟出現(xiàn)充血，腸道有積液，且鼻腔也出現(xiàn)黏液。

1.2 試驗材料

培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，按通用的組方自行配制。其中麥康凱瓊脂粉為上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司產品，瓊脂粉與氯化鈉為國藥集團化學試劑有限公司產品，蛋白胨與胰酶為OXOID公司產品。

染色液：革蘭氏染色液。

生化發(fā)酵管：生化反應管為上海市醫(yī)學化驗所試劑廠產品，計14種。

藥敏試紙片：杭州天和微生物公司生產，計16種。

1.3 方法

1.3.1 細菌分離培養(yǎng)

無菌操作從病死的鴿肝臟取樣，接種于LB平板，置于37℃溫箱中培養(yǎng)24h后觀察菌落特征，待典型菌落出現(xiàn)后，再挑取典型菌落接種到麥康凱培養(yǎng)基上同樣置溫箱培養(yǎng)24h備用。

1.3.2 細菌的鑒定

形態(tài)學鑒定：從純培養(yǎng)的麥康凱瓊脂平皿上挑取菌落制成涂片，作革蘭氏染色，然后在高倍油鏡

張彬彬 邵慧君 王彥紅 劉文博下觀察。

生化鑒定：按常規(guī)方法進行。將所獲得分離菌的純培養(yǎng)菌落1～2個，分別接種于各種微量生化發(fā)酵管內，置37℃溫箱培養(yǎng)24～48h，定時檢查反應結果。

1.3.3 藥物敏感性試驗

用接種環(huán)挑取單個菌落涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，再放藥敏紙片，置37℃溫箱培養(yǎng)18h。觀察測量抑菌圈的大小并記錄結果。此次選用16種抗菌藥物：鏈霉素（30μg）、復方新諾明（23.7/1.25μg）、慶大霉素（10μg）、氯霉素（30μg）、呋喃妥因（300μg）、美洛西林 （75μg）、萘啶酸 （30μg）、氟羅沙星（5μg）、羧芐青霉素（100μg）、卡那霉素（30μg）、四環(huán)素（30μg）、左氟沙星（5μg）、恩諾沙星（5μg）、阿米卡星（30μg）、頭孢西丁（30μg）和頭孢噻肟（30μg）。藥物敏感性的判定標準采用中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準的紙片法抗菌藥物敏感試驗標準。

1.3.4 病毒分離

取病死鴿的腦、氣管、肺和肝研磨，加入含雙抗（青霉素、鏈霉素每毫升各 1000IU）PBS制成1∶5的組織液，凍融3次,5000r/min，離心10min,取上清液接種 9～11日齡 SPF雞胚，每枚 0.2mL，置37℃溫箱培養(yǎng)，觀察結果，收集尿囊液檢測其血凝性并盲傳3代。

2 結果

2.1 細菌分離

原代細菌在LB培養(yǎng)基上為濕潤，直徑2～4mm的乳白色菌落，第二代在麥康凱培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h后出現(xiàn)2～4mm大小的亮粉紅色菌落，周圍有沉淀線環(huán)繞。革蘭氏染色呈典型的革蘭氏陰性中等大小的桿菌。

2.2 生化特性

取純培養(yǎng)的細菌進行生化試驗，由其結果與上述細菌培養(yǎng)特性結合分析得出，所得的細菌為大腸桿菌，生化反應結果：葡萄糖、蔗糖、乳糖、阿拉伯糖、麥芽糖、甘露醇和山梨醇為陽性；衛(wèi)矛醇、蛋白胨、尿素、水楊苷、硫化氫、木糖和肌醇為陰性。

2.3 藥敏試驗

大腸桿菌的耐藥性由培養(yǎng)基上所選擇抗菌藥物的抑菌圈大小與敏感標準來判定，其結果表明，所分離的鴿大腸桿菌除了對頭孢噻肟高度敏感外，對鏈霉素、復方新諾明和慶大霉素等15種藥物均不敏感，見表1。

2.4 病毒分離

組織液接種SPF雞胚后培養(yǎng)至120h，雞胚仍無死亡和病變，其尿囊液無血凝性，盲傳3代仍無血凝性，認為未分離到病毒，棄之。

3 小結與討論

3.1 送檢病死鴿組織中未分離到病毒。由病原菌的形態(tài)學特征、培養(yǎng)特性及生化試驗確定引起鴿死亡的原因是大腸桿菌感染導致的急性敗血癥，用慶大霉素和阿米卡星治療不佳的原因可從藥敏結果得到解釋。較多研究結果表明：大腸桿菌對多種藥物敏感[2～4]：如環(huán)丙沙星、恩諾沙星、先鋒5號及氯霉素高度敏感，而由本次藥敏試驗顯示該養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖上濫用抗生素的情況已十分嚴重，已經產生了對卡那霉素、慶大霉素、氯霉素和鏈霉素均耐藥的菌株，在所選的16種抗菌藥物中除了頭孢噻肟，其余藥物對該菌株均產生不同程度的耐藥，應引起養(yǎng)殖戶的高度重視。因此建議在確診的基礎上，通過藥敏試驗，有目的、有針對性地用藥，避免濫用藥物，

且用藥應有足夠療程和劑量，或在使用抗菌藥物的過程中注意交叉用藥或聯(lián)合用藥，以避免菌株耐藥性的增強，盡量減少耐藥菌株產生。

表1 大腸桿菌分離株對16種抗菌藥物的耐藥性

3.2 為了防止該病的發(fā)生，要提高機體抵抗力，給予全面營養(yǎng)，飼料中補充足量維生素、微量元素，同時要注意搞好環(huán)境衛(wèi)生，定期對本地區(qū)鴿大腸桿菌進行耐藥性監(jiān)測及使用疫苗加強免疫，這些措施均能有效預防鴿大腸桿菌病的發(fā)生，從而減少臨床用藥，減少耐藥菌株產生，以降低疫病防治的難度。

[1]塞弗（美）主編.禽病學［M］.第 11版.蘇敬良，高福，索勛主譯.北京：中國農業(yè)出版社，2005，174-176.

[2]李鵬,王家鄉(xiāng).鴿大腸桿菌病的診斷及防治［J］.湖北畜牧獸醫(yī)，2006，8∶34.

[3]曾桂有.鴿大腸桿菌病的診治［J］.中國禽業(yè)導刊，2001，18(13)∶23.

[4]趙光偉，鄭琳紅，張成偉，等.鴿場大腸桿菌和沙門氏菌的分離鑒定及其藥敏試驗[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2010，6∶11-13.

S854.4+3

A

1008-3847（2011）05-0006-02

丁煥中