糖基轉移酶反應的基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法監測

周大煒,劉 斌,吳俊麗,胡 波,齊源遠

(1.南開大學泰達生物技術學院,天津 300457;2.天津市微生物功能基因組學重點實驗室,天津 300457;3.南開大學分子微生物學與技術教育部重點實驗室,天津 300457)

糖基轉移酶反應的基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜法監測

周大煒1,2,3,劉 斌1,2,3,吳俊麗1,2,3,胡 波1,齊源遠1

(1.南開大學泰達生物技術學院,天津 300457;2.天津市微生物功能基因組學重點實驗室,天津 300457;3.南開大學分子微生物學與技術教育部重點實驗室,天津 300457)

以w abD(大腸桿菌O77中O抗原基因簇內)編碼的α-1,3-甘露糖轉移酶、w fgD(大腸桿菌O152中O抗原基因簇內)編碼的β-1,3-葡萄糖轉移酶和w feD(志賀氏菌鮑氏O14中O抗原基因簇內)編碼的β-1,4-半乳糖基轉移酶酶促反應產物為研究對象,嘗試應用碰撞誘導解離 (CID)負離子模式基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜 (MALD I-TOFM S)技術建立簡單、高效的糖基轉移酶監測方法。該方法首先直接用質譜分析0.3μL未經色譜分離、除鹽處理的反應混合物,隨后應用CID串聯質譜技術對酶活反應產物進行結構表征,實現酶活反應的快速檢測。研究結果表明,CID MALD I-TOFMS平臺適用于新建克隆的糖基轉移酶酶活反應的監測,與現有的高通量方法相比,在速度、靈敏度、重現性、自動化和溶劑消耗方面具有絕對優勢。

脂寡糖;糖基轉移酶;基質輔助激光解吸離子化-飛行時間質譜(MALD I-TOFMS)

糖基轉移酶是負責催化合成系列糖復合物(如糖蛋白、糖脂和蛋白多糖中的糖苷鍵)的一類重要的酶。糖基轉移酶的催化作用對于蛋白和脂翻譯后修飾的糖基化反應至關重要,顯著影響各種各樣的分子-識別過程:如細菌/病毒感染、細胞黏著、免疫響應、細胞分化、生長和控制及很多其他細胞間的通訊和信號轉導。研究發現,一些細菌中的糖基轉移酶和宿主中相對應的糖基轉移酶有結構上的同源區域[1],這是細菌為了逃避動物和人的免疫系統,其表面帶有一些與人或動物細胞的糖鏈具有相似結構的結果。對合成這些糖的糖基轉移酶的研究將對醫療和生物制藥有著重要的意義。

盡管糖基轉移酶有如此重要的作用和功能,但是從國內外的研究現狀來說,對糖基轉移酶的研究手段并不成熟,表現在現有超過20 000種已知序列可能編碼此類酶的基因中(http://afmb.cnrs-m rs.fr/CAZY/),僅有不到5%的假定糖基轉移酶基因的特定功能,在純化制備酶促反應產物的基礎上,應用核磁共振(NM R)技術得到了明確鑒定[2-3],關于這種多樣性的細節所知甚少。

原則上,一個糖鏈的完整結構僅從NMR實驗的綜合就可以推導出來,這已成為糖基轉移酶基因功能鑒定的首選方法[2-3]。但其主要缺點是靈敏度較低,特別是涉及耗時的分離純化制備步驟。基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜(MALD I-TOF M S)能測定完整的糖鏈分子質量,同時還可以應用碰撞誘導解離(CID)技術進行寡糖序列測定,而且MALD I-TOFM S技術已成功用于多種酶的酶活監測[4-5]。因此,結合已知糖類生化合成途徑的專業知識,可以勝任糖基轉移酶酶活的監測和初步表征工作。本工作以本實驗室前期應用NM R技術已證明其基因功能的3個糖基轉移酶:w abD編碼的α-1,3-甘露糖基轉移酶(大腸桿菌 O77)、w fgD編碼的β-1,3-葡萄糖基轉移酶 (大腸桿菌 O152)和w feD編碼的β-1,3-半乳糖基轉移酶(志賀氏菌鮑氏O14)的酶促反應產物為研究對象,其化學結構示于圖1,嘗試通過MALD I-TOF MS技術分析酶活產物的形成,并在進一步應用 CID MALD I-TOF MS技術對酶活產物的結構進行表征的基礎上,建立新的簡單、高效、靈敏和準確的糖基轉移酶活性監測方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

基質輔助激光解吸電離-飛行時間質譜儀(4700 Proteomics Analyzer):美國 App lied Biosystem s公司產品。甲醇、乙腈(色譜純):美國Fisher 公 司 產 品;α-氰 基-4-羥 基 肉 桂 酸(α-CHCA):美國 Fluka 公司產品;水為二次重蒸水;GDP-M an、UDP-Glc和 UDP-Gal:購自Sigma-A ldrich公司;本實驗涉及的菌株、質粒、酶及其他生化試劑參見文獻[6]。

圖1 大腸桿菌O77,O152和志賀氏菌鮑氏O14 O抗原的化學結構Fig.1 The O-antigen structures of E.coliO77,O152 and S.boydiiO14

1.2 酶活反應

大腸桿菌O77和O152抗原中w abD基因、w fgD基因和志賀氏菌鮑氏O14抗原中w feD基因的克隆、含相應重組質粒的細菌培養及酶活反應細胞膜提取物的制備按文獻[4]方法進行。由于w fgD、w feD和w abD與細胞膜之間存在相互作用,本工作利用含w abD或w fgD或w feD基因的重組質粒細胞膜部分作為酶的來源進行酶促反應。

標準40μL反應體系為:1 mmol/L受體GlcNAc-PP-PhU(空白對照以二次重蒸水替代),5 mmol/L M nCl2,75 mmol/L M ES buffer(p H 7),5 mmol/L GDP-M an(或UDP-Glc,或UDP-Gal)和10μL細菌膜提取物(含1～12 μg蛋白質,陰性對照分別以大腸桿菌DH5α和BL 21替代)。37℃水浴中反應15 min后,沸水浴中加熱 3 m in,以 12 000 r/min離心 5 m in。將上清液稀釋200倍后,取0.3μL待測液與等體積基質,滴于質譜靶樣品點心,室溫干燥,結晶后直接分析測試。

w abD酶促反應產物(Man-α-1,3-GlcNAcα-PO3-PO3-(CH2)11-OPh),w fgD酶促反應產物 (Glc-β-1,3-GlcNAc-α-PO3-PO3-(CH2)11-OPh)和w feD酶促反應產物(Gal-β-1,4-Glc-NAc-α-PO3-PO3-(CH2)11-OPh)的化學結構示于圖2。

1.3 MALD I-TOFMS分析條件

基質為α-CHCA,激光器 Nd:YAG,波長355 nm,反射模式,負離子譜檢測。串聯質譜實驗中,高能碰撞誘導解離(CID)碰撞小室內空氣為碰撞氣體,其壓力維持在3.33×10-4Pa,碰撞能量1 kV。為質譜解析方便,暫且把預期的酶促反應產物——苯氧基十一烷基二磷酸二糖當成五糖(寡糖),苯氧基十一烷基和二磷酸基相應地分別代表1個和2個糖環。所有碎片應用Domon-Costello命名法識別[7]。

圖2 wab D(a),w f g D(b)和w fe D(c)酶促反應產物的化學結構Fig.2 The structures of w ab D product(a),w f g D product(b)and w f e D product(c)

2 結果與討論

2.1 wab D、w f g D和w fe D酶活性的質譜監測

在負離子模式下,分別利用含w abD、w fgD、w feD基因的重組質粒和大腸桿菌BL21(不含質粒)的細胞膜部分作為酶的來源進行酶促反應,MALD I-TOFM S譜圖示于圖3。這里,以w abD催化反應產物為例(圖3c),豐度強的準分子離子峰m/z789.304 6[M-H]-與M an-GlcNAc-PP-PhU的分子質量相對應,顯示w abD具有明顯的甘露糖轉移酶活性;而以大腸桿菌BL 21(不含質粒)的細胞膜作為酶活反應的陰性對照(圖3a)和以水代替給予體底物(圖3b)進行酶促反應的空白對照在酶活檢測中均完全沒有相應的糖基轉移酶活性。證明反應中的甘露糖基轉移酶活性由含有w abD基因的質粒產生。

同理可以證明:w fgD(圖 3d)和w feD(圖3e)反應中的葡萄糖和半乳糖基轉移酶活性分別由含有w fgD和w feD基因的質粒產生。

到目前為止,已報道的糖基轉移酶酶活性監測方法有放射性薄層層析法,色譜法[8],光譜法和質譜法[9]。這些方法或者需要放射性標記的給予體底物,或底物和產物都需要含發色團,或者需要特別的樣品前處理(質譜法),普遍存在耗時長、實驗程序繁瑣等缺陷。本工作建立的MALD I-TOF M S分析法涉及的樣品前處理僅需加熱除蛋白和適當的稀釋處理,從酶促反應開始到獲得最終的質譜結果,整個過程不超過30 min。

2.2 wab D、w f g D和w fe D酶活性的初步表征

圖4、5和6分別給出了負離子模式下w abD、w fgD和w feD反應產物分子離子的二級質譜圖。這里以w abD催化反應產物為例,以m/z789.304 9[M-H]-為前體離子,觀察到4個源于磷酸二脂鍵部分碎裂的MS2產物離子,分別為m/z444.574 9[B3],m/z524.626 5[B4],m/z462.603 4[C3]和m/z405.549 1[Z3];源于糖苷鍵斷裂的產物離子有m/z241.296 6[Y4]和m/z423.569 9[Y3];m/z79.173 9[PO3]-和m/z159.097 9[HPO3PO3]-源于磷酸二脂鍵部分2個鍵的同時碎裂;未發現涉及開環的產物離子。

酶促反應產物二級質譜圖中的 Y型離子,即m/z241.296 6[Y4]和m/z423.569 9[Y3]源于糖苷鍵的斷裂,表明酶促反應產物二糖的連接序列為M an-GlcNAc-PP-PhU。

w f gD(圖5)和w feD(圖 6)反應產物分子離子的二級質譜圖中的碎片離子組成同w abD(圖4)基本一致,表明3種酶活產物的裂解機理相似。同理可以證明,相應的酶促反應產物二糖的連接序列分別為 Glc-GlcNAc-PP-PhU和Gal-GlcNAc-PP-PhU。

圖 3 陰性對照(a)、空白對照(b)、wab D(c)、w f g D(d) 和w f e D(e)催化產物的MALD I-TOFMS譜圖Fig.3 MALD I-TOFMS spectrum of negative con trol(a)、blank control(b)、wab D product(c)、w f g D product(d)and w fe D product(e)

圖4 wab D催化反應產物的CID MALD I-TOFMS譜圖Fig.4 CID MALD I-TOFMS spectrum of wab D product MS2 of m/z 789.304 9

圖5 w f g D催化反應產物的CID MALD I-TOFMS譜圖Fig.5 CID MALD I-TOFMS spectrum of w f g D product MS2 of m/z 789.303 4

圖6 w fe D催化反應產物的CID MALD I-TOFMS譜圖Fig.6 CID M ALD I-TOFMS spectrum of w f e D product MS2 of m/z 789.307 4

3 結論

本工作研究了負離子模式下3種酶活產物(w abD基因、w fgD基因和w feD基因編碼的)混合物的 MALD I-TOF M S和 CID MALD ITOF M S質譜表征,結果表明,w abD基因、w fgD基因和w feD基因分別具有葡萄糖、甘露糖和半乳糖基轉移酶活性,這與已獲得的2DNM R(600 M Hz)分析結果一致。本工作建立的簡單、靈敏、快速、準確酶活監測手段和酶活性初步表征方法,對O-抗原生物合成路徑中細菌糖基轉移酶基因功能的高通量篩選具有普遍適用性,將為重組疫苗和應用生物技術大規模合成功能性糖鏈奠定基礎。

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Monitoring of Glycosyltransferase Reactions by MALD I-TOFMass Spectrometry

ZHOU Da-wei1,2,3,L IU Bin1,2,3,
WU Jun-li1,2,3,HU Bo1,Q I Yuan-yuan1
(1.TEDA School of Biological Sciences and Biotechnology,N ankai University,Tianjin 300457,China;2.The Engineering and Research Center for Microbial Functional Genom ics and Detection Technology,Ministry of Education,Tianjin 300457,China;3.The Key Laboratory of Molecular Microbiology and Technology,Ministry of Education,Tianjin 300457,China)

Novel gram-negative bacteria have lipopolysaccharides terminating in repeating oligosaccharides which comp rise the O-antigen.The glycosyltransferases(GTs)assembling the O-chain utilize lipid-linked acceptor substrates and nucleotide sugar donor substrates.However,the lack of a rapid and simplemethod for monitoring glycosyltransferase activity p reclude the elucidation of the function of putative GTs.Mass spectrometry is a rapid,sensitive,and accurate approach for the direct monito ring of enzyme-catalyzed reactions that does not require a chromopho re or radiolabeling and thus provides a viable alternative to ex-

isting analytical techniques.In this study,a simple and efficient assay for glycosyltransferase activity by matrix-assisted laser desorp tion-ionization(MALD I)mass spectrometry with collision-induced dissociation(CID)was demonstrated byw abD(in E.coli O77 O-antigen gene cluste)enzymatic reaction,w fgD(in E.coli O152 O-antigen gene cluste)enzymatic reaction andw feD(in S.boydii O14 O-antigen gene cluste)enzymatic reaction,respectively.The rapid and direct detection of the enzymatic reaction w as achieved by subjecting a small amount(0.3μL)of the reaction mixture to M S analysis without chromatographic separation or desalting steps,and subsequent M S-M S analyses of the product via collision-induced dissociation enabled the structures of products of enzyme-catalyzed reactions to be determined.Collectively,these data demonstrate that CID MALD I-TOF M S based platform is applicable to the facile determination of the enzymatic activity of other new ly cloned glycosyltransferases and offers significant advantages over current H T Smethods in terms of speed,sensitivity,reproducibility,automation and reagent costs.

glucosyltransferase;lipooligosaccharide;matrix-assisted laser desorption-time of flight mass spectrometry(M ALD I-TOF M S)

O 657.63

A

1004-2997(2011)04-0193-07

2010-11-30;

2011-03-09

南開大學引進人才科研啟動資金(No.J02006)資助

周大煒(1966～),女(漢族),吉林通化人,副研究員,功能基因組學專業。E-mail:daweizhou@nankai.edu.cn