紫杉醇長效PLGA微球的制備、性質及其在體內抗H22型肝癌的療效

呂 偉 裴 瑾 王 斕 張海鋒 柳懷玉 韓 冰 (吉林大學藥學院生物藥學系，吉林 長春 300)

紫杉醇長效PLGA微球的制備、性質及其在體內抗H22型肝癌的療效

呂 偉 裴 瑾 王 斕1張海鋒 柳懷玉2韓 冰 (吉林大學藥學院生物藥學系，吉林 長春 130021)

目的 制備長效紫杉醇聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)微球，對微球的常規理化特性、體外釋放特性進行考察并對該微球的抗肝癌療效進行鼠體內評估。方法 采用單乳溶劑揮發法制備紫杉醇PLGA微球成功后利用激光粒度分析儀測定其平均粒徑，利用掃描電鏡觀測微球表面形貌，對3批微球樣品進行載藥量及體外釋放檢測，構建小鼠H22肝癌模型，以瘤內方式給藥，給藥15 d后觀測腫瘤病理切片，評估療效。結果 微球表觀平整，形態圓滑，平均粒徑為36.4μm，3批樣品平均載藥量為7.42%，可維持30 d左右的體外釋放，體內實驗顯示微球具備良好抗H22型肝癌療效。結論 所制備的紫杉醇PLGA緩釋微球具備良好的理化特性、體外釋放特點并具備良好的抗腫瘤療效。

紫杉醇;PLGA;微球;H22型肝癌

紫杉醇是從植物紫杉中提取的一種化合物，是近些年來發現的一種高效抗腫瘤藥物〔1〕，其高效的抗腫瘤特性已在包括卵巢癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤的治療方面得到了驗證〔2～4〕。作為細胞微觀的特異性穩定劑，紫杉醇可促進微管蛋白聚合，抑制解聚，從而抑制細胞的有絲分裂，使腫瘤細胞周期中止，由此起到抗腫瘤功效〔5〕。有研究將紫杉醇用于肝癌治療，發現紫杉醇可影響肝癌細胞的細胞外信號轉導，從而引起細胞凋亡，并且可抑制肝腫瘤組織血管形成及肝癌細胞轉移〔6〕。對紫杉醇進行劑型改造，保護藥物，延長其體內存留時間是近年來研究熱點。本研究在紫杉醇具備良好的抗肝癌療效的基礎上，進一步將其制備成了紫杉醇PLGA緩釋微球劑型，延長了紫杉醇發揮抗腫瘤作用的時間，提高其生物利用度。對制備得到的微球進行了表觀形貌、粒徑、載藥量、體外釋放等特性的分析，并以H22肝癌模型小鼠為實驗對象研究了紫杉醇微球的動物體內抗腫瘤藥效。

1 材料與方法

1.1 材料 紫杉醇購于Sigma公司;PLGA購于美國Lakeshore公司;二氯甲烷、乙腈等常規試劑購于北京化工;BS124S型電子天平(德國Sartorious公司);JY88-IIN型超聲細胞破碎儀(寧波新芝);高速勻漿器(德國IKA公司);馬爾文2000激光粒度分析儀(英國Malvern公司);日立S-2700掃描電鏡(日本Hitachi公司);高效液相色譜儀(德國Agilent公司)。

1.2 紫杉醇PLGA微球的制備 取一定量的PLGA，加入二氯甲烷溶液中，制備成乳狀溶液，向其中加入一定量的紫杉醇和PLGA的二氯甲烷溶液共同溶解，超聲處理。將此溶液逐滴加入到30 ml聚乙烯醇(PVA)水溶液中，高速攪拌，之后加水稀釋，將PVA濃度控制在2%，500 r/min低速攪拌2 h。將外水相濾出，對剩余溶液進行反復離心、洗滌。最后向其中加入2.5%的甘露醇進行凍干。

1.3 微球的表面形貌觀測及粒徑測定 取一定量的微球樣品經過包埋并進行鍍金處理后利用掃描電鏡進行表面形貌的觀測。利用激光粒度分析儀對微球的粒徑進行測定。

1.4 微球的載藥量測定 取5 mg微球樣品，將之置于10 m l離心管底部，向其中加入2 ml二氯甲烷溶液，靜置2 min，將微球溶解后加入5 ml50%的乙腈溶液，渦旋振蕩處理，通入氮氣揮發二氯甲烷，之后利用高效液相對紫杉醇進行檢測，利用上述方法對3批制備得到的微球分別進行載藥量測定。

1.5 微球的體外釋放檢測 取20 mg微球樣品，置于10 m l離心管底部，加入5 m l pH7.0 PBS緩沖液，封口膜封口，將離心管置于37℃的搖床中，120 r/min進行搖動，固定時間點離心，取出4 m l上清液，其中20 ml用于液相檢測，其余棄掉，同時向離心管中補充4 ml新鮮PBS緩沖液，使釋放繼續進行。每到相應檢測時間點重復上述檢測。共對3批制備得到的微球樣品進行體外釋放檢測，繪制3批樣品的平均釋放曲線。

1.6 微球抗肝癌療效試驗 利用H22腹水型肝癌小鼠的腹水，對昆明小鼠進行腹腔接種，連續接種5代，得到穩定的H22肝癌腹水瘤小鼠后再次抽取其腹水，細胞計數，調整腫瘤細胞濃度至5×106m l－1，接種于昆明小鼠前肢足墊，待腫瘤體積增長至1 cm3時造模成功。選取30只模型鼠，隨機分為3組，每組10只。包括陰性對照組(瘤內注射生理鹽水，首次給藥作為實驗第1天，之后每隔5 d注射一次，共注射5次);陽性對照組(瘤內注射9 mg/kg常規紫杉醇，首次給藥作為實驗第1天，之后每隔5 d注射一次，共注射5次);微球給藥組(一次性瘤內注射45 mg/kg紫杉醇微球，按紫杉醇計)。以28 d為一個給藥周期，首次給藥28 d后處死所有動物，取腫瘤組織制片，鏡檢。

2 結果

2.1 微球的表面形貌及粒徑 所得到的微球表觀平整，形態圓滑(圖1)。微球的平均粒徑為36.4μm。

2.2 微球的載藥量 3批微球載藥量分別為7.34%、7.52%、7.41%，平均7.42%，各批次制備的微球載藥量無顯著差異(P＜0.05)，證明微球制備的工藝重現性良好。

2.3 微球的體外釋放 3批微球的體外釋放曲線見圖2，微球的體外藥物釋放均勻，釋放周期可維持30 d左右，在整個釋放周期內可實現接近90%的藥物積累釋放。

圖1 紫杉醇PLGA微球表觀形貌

圖2 紫杉醇PLGA微球的藥物體外釋放曲線

2.4 微球抗肝癌療效 首次給藥28 d后對不同實驗分組小鼠的肝癌實體瘤進行病理切片檢測，陰性對照組瘤組織腫瘤細胞散在分布，結節不清，絕大部分細胞核巨大，呈低分化狀態;陽性對照組瘤組織脂肪為散在部分，多數肝細胞呈低分化狀態;微球給藥組瘤組織發生部分脂肪變，肝細胞呈條索狀分布，邊界較為清晰，切面較均勻(圖3)。紫杉醇微球制劑可明顯抑制腫瘤的惡性分化，并且比常規紫杉醇制劑具備更好的抑瘤療效。到了廣泛應用。與脂質體等包埋輔料相比，利用PLGA作為緩釋材料可使藥物在體內存留的時間更長，發揮藥效時間更持久，本研究所制備的微球在體外可持續釋放30 d左右，有利于肝癌的長期治療。已上市微球制劑的給藥方式多采取皮下給藥或肌肉給藥〔10，11〕，兩種給藥方式均屬于組織局部給藥，微球給藥方式的選擇與微球藥物體內藥代動力學相適應，隨著PLGA生物相容性材料在體內的緩慢降解，藥物可實現在微球植入靶點的逐漸釋放。本研究制備得到的微球采取瘤內直接注射的給藥方式，實現了針對腫瘤靶點的治療。從首次給藥28 d后的腫瘤病理切片的觀測上也充分印證了所制備的紫杉醇微球具備良好的抗腫瘤療效。

圖3 不同實驗分組肝癌病理切片對比(×40)

3 討論

已有研究將紫杉醇裝載于脂質體、明膠、PLA〔7～9〕等材料中實現藥物緩釋。所選擇的緩釋材料既要具備良好的生物相容性又要求其降解特性滿足預期藥物發揮作用的時間。PLGA作為新型的藥物包埋輔料，以其無毒、生物相容性良好的特點得

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R735.7

A

1005-9202(2011)12-2284-02

1 沈陽藥科大學制藥工程學院化學實驗中心

2 吉林大學動物實驗中心

韓 冰(1980-)，男，講師，博士，主要從事藥物制劑研究。

呂 偉(1984-)，男，碩士，主要從事藥物制劑研究。

〔2010-11-10收稿 2011-03-07修回〕

(編輯 張 慧)