基質金屬蛋白酶-9對斑塊穩定性的影響及強力霉素的干預效果

李學遠 夏 豪 (武漢大學人民醫院心血管內科，湖北 武漢 430060)

基質金屬蛋白酶-9對斑塊穩定性的影響及強力霉素的干預效果

李學遠1夏 豪 (武漢大學人民醫院心血管內科，湖北 武漢 430060)

目的 探討基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)與大鼠動脈粥樣硬化斑塊穩定性的關系及強力霉素的干預效果。方法 36只雄性Wistar大鼠隨機分為對照組(C組)、動脈粥樣硬化組(A組)和強力霉素干預組(D組)，A組和D組給予高脂飼料+維生素D3腹腔注射，D組同時予強力霉素10 mg·kg－1·d－1腹腔注射一次。于第14周確定造模成果后測量血清MMP-9、血漿超敏C反應蛋白(hs-CRP)水平，取主動脈石蠟包埋切片，HE染色，觀察斑塊形態，計數易損斑塊數目。結果 D組血MMP-9、hs-CRP水平均低于A組(P＜0.01，P＜0.05)，而高于C組(P＜0.01);各組MMP-9與hs-CRP水平呈正相關(r=0.928，P＜0.01)。D組血管內膜/中膜面積比及易損斑塊計數較A組均降低(P＜0.05，P＜0.01)。結論 強力霉素可以通過抑制MMP-9活性達到穩定動脈粥樣硬化斑塊的作用。

基質金屬蛋白酶-9;斑塊穩定性;強力霉素;C反應蛋白

易損斑塊破裂、出血及形成血栓是急性冠脈綜合征發病的主要機制〔1〕。研究顯示易損斑塊內基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達明顯增加，致基質膠原合成與降解失衡，降解多于合成〔2〕，是造成斑塊纖維帽變薄，斑塊潰瘍或破裂的重要因素。MMP-9由斑塊內的巨噬細胞、單核細胞等炎癥因子分泌，高敏C反應蛋白(hs-CRP)是反應體內炎癥活動的敏感性指標，目前認為MMP-9與hs-CRP聯合檢測可評價預測斑塊穩定性的指標。本文應用MMPs抑制劑強力霉素干預動脈粥樣硬化大鼠MMP-9的活性表達，并檢測血清MMP-9水平及hs-CRP水平變化，觀察動脈粥樣硬化斑塊形態，以探討MMP-9與斑塊穩定性的關系及強力霉素的干預效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器與試劑 健康純種雄性Wistar大鼠36只(SPF級)武漢大學人民醫院動物實驗中心提供，體重220～260 g。MMP-9 ELISA試劑盒購于TPInIc公司，免疫組化染色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，高速離心機(德國Eppendorf公司)、紫外分光光度計(日本Shimadzu公司)、電子天平由武漢大學心血管病學實驗室提供。強力霉素粉購于Sigma公司，實驗時以0.9%生理鹽水按2∶1比例配成注射液。

1.2 模型建立與分組 36只大鼠隨機分為對照組(C組)、動脈粥樣硬化組(A組)和強力霉素干預組(D組)。C組只給予普通飲食，A組和D組每天給予按“3%膽固醇、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、5%白糖、10%豬油、81.3%基礎飼料”配制的高脂飼料約20 g，飲水不限，喂食開始時腹腔注射維生素D3 70萬IU/kg，分3 d給完，每隔1個月追加一次維生素 D3 30萬/kg。D組在造模同時每天一次腹腔注射強力霉素10 mg/kg，C組和A組給予等劑量0.9%生理鹽水處理。于喂養12 w后處死A組大鼠一只，甲醛固定胸主動脈，石蠟包埋，連續切片，切片固定于載玻片上，HE染色，光學顯微鏡示粥樣硬化的病理特征出現，確定造模成功，進行下一步實驗。

1.3 指標測定 于第14周給予3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，開胸取左心室腔血 2 ml，4℃3 000 r/min離心10 min后取血清，雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測MMP-9水平，采用酶法并用全自動生化分析儀測定血清hs-CRP水平;取升主動脈起始部約2～3 cm左右的動脈段于10%中性甲醛溶液固定，常規脫水、固定、透明、包埋、切片，進行HE染色，光鏡觀察形態學特點，應用圖像分析儀測量內膜、中膜厚度，計算內膜/中膜面積比(I/M)。

1.4 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件包處理，計量數據采用±s表示，行方差分析，各組均數間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls法，計數資料采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 血清MMP-9及hs-CRP水平 D組血清MMP-9、hs-CRP水平均明顯低于A組(P＜0.01)，但明顯高于C組(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清學指標水平(±s)

表1 各組大鼠血清學指標水平(±s)

與C組比較:1)P＜0.05;與A組比較:2)P＜0.05

組別 n MMP-9(μg/ml) hs-CRP(μg/ml)10 0.57±0.21 518.04±53.98 A組 10 5.16±0.891) 1 436.31±59.911)D組 10 1.59±0.551)2) 924.56±69.311)2)C組

2.2 HE染色結果 光鏡下觀察，C組主動脈管腔完整光滑，各層結構清晰;A組和D組管腔均明顯變窄，內膜明顯增厚，中膜平滑肌細胞排列紊亂，A組內膜內含大量泡沫細胞及炎癥細胞，D組可見鈣化斑塊形成。將脂質核心大于斑塊40%者判定為易損斑塊，A組易損斑塊數及斑塊I/M明顯高于D組和C組(P＜0.01)，而 D組與 A組間無統計學差異(P＞0.05)，見表2。

表2 各組易損斑塊數及I/M比較

3 討論

急性冠脈綜合征的發生絕大部分是由其斑塊的穩定性而非斑塊的大小決定的〔1〕，近來提出的易損斑塊即是指在結構和功能上具有易損性并可能快速進展成為罪惡斑塊的那些粥樣硬化病變。本研究根據Naghavi等〔3〕的標準將脂質核心大于斑塊體積40%以上者判定為易損斑塊。MMPs是一類活性依賴于鋅離子和鈣離子的蛋白水解酶類，主要的生理功能是降解ECM 成分，如膠原、明膠、彈性蛋白等〔4～6〕，MMP-9是其中的一種，即明膠酶B，MMP-9能直接降解內皮基質，使斑塊纖維帽變薄從而削弱斑塊穩定性〔7，8〕。研究表明急性冠脈綜合征患者血清MMP-9水平明顯升高，且證實是冠脈內斑塊破裂釋放入血循環引起〔9〕。本研究證實了MMP-9水平與斑塊穩定性密切相關，其水平升高可以作為判定斑塊不穩定的血清學指標之一。

強力霉素屬四環素類抗生素，大劑量時具有抗菌作用，而在小劑量時能螯合金屬離子從而起到抑制MMPs的活性的作用〔10，11〕。本研究以 10 mg·kg－1·d－1的小劑量強力霉素作用與動脈粥樣硬化大鼠模型后，發現與動脈粥樣硬化組比較，其血脂水平無明顯變化，但血清MMP-9水平明顯降低，穩定斑塊數增加，提示強力霉素可以通過抑制MMP-9的活性而增強斑塊穩定性，且這一作用與血脂的代謝水平無關。有研究顯示，MMP-9除能直接降解基質降低斑塊纖維帽強度外，還可能參與了斑塊內新生血管的生成，而新生血管又可增加斑塊內炎癥細胞因子的侵入，活化的炎性細胞又可分泌生長因子和釋放MMPs，由此激發了正反饋機制，促進斑塊的發生發展，甚至誘發斑塊內出血和斑塊破裂〔12〕。本研究發現，強力霉素雖不能直接抑制MMP-9的合成，但強力霉素組MMP-9水平仍明顯降低，可能與強力霉素抑制了MMP-9的活性后，阻斷上述正反饋機制有關。

目前普遍認為動脈粥樣硬化是動脈壁對脂質沉積的一種炎癥纖維增生性反應〔13〕，而hs-CRP被公認是反映體內炎癥活動的敏感性指標，并且可以作為判斷斑塊的穩定性的間接指標〔14〕。本研究中，強力霉素組血清hs-CRP水平較動脈粥樣硬化組顯著降低，而其易損斑塊數也明顯降低，這與劉海波〔15〕等通過冠狀動脈造影發現血清CRP水平與斑塊形態特征存在正相關的報道相一致，表明強力霉素干預能夠增強斑塊穩定性，減少斑塊內炎癥活動。而強力霉素減少炎癥活動的作用是由于阻斷了上述正反饋機制，抑或本身即具有抗炎作用所致目前尚不明確，有待進一步研究。

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R543.31

A

1005-9202(2011)12-2282-02

1 黃石市第二醫院

夏 豪(1966-)，男，主任醫師，博士生導師，主要從事冠心病防治研究。

李學遠(1980-)，男，碩士，主要從事心血管疾病的診治研究。

〔2010-06-18收稿 2010-09-20修回〕

(編輯 劉 愉/曹夢園)