NGF誘導PC12細胞分化晚期的蛋白質(zhì)組學研究

侯 澍 張 磊 李紅杰 胡林森 (首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 0008)

NGF誘導PC12細胞分化晚期的蛋白質(zhì)組學研究

侯 澍 張 磊1李紅杰2胡林森3(首都醫(yī)科大學附屬北京世紀壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京 100038)

目的 研究神經(jīng)生長因子(NGF)誘導PC12細胞分化晚期的細胞蛋白質(zhì)組變化，探索NGF誘導細胞分化的分子機制。方法50 ng/m l NGF作用于PC12細胞96 h，提取細胞總蛋白，應(yīng)用熒光差異凝膠電泳(DIGE)獲取蛋白點的差異表達信息，運用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定出差異蛋白質(zhì)。結(jié)果 NGF誘導96 h后，共有58個蛋白點發(fā)生變化，質(zhì)譜鑒定出了10種蛋白。結(jié)論 本實驗首次應(yīng)用DIGE技術(shù)篩選NGF誘導PC12細胞分化晚期的相關(guān)蛋白，其中5種蛋白是首次在NGF誘導的PC12細胞中被報道。這些蛋白可能是NGF信號轉(zhuǎn)導過程的新成員，也可以成為藥物治療的新靶點。

蛋白質(zhì)組學;DIGE;NGF;PC12細胞

神經(jīng)生長因子(NGF)是最早被發(fā)現(xiàn)和分離純化的多肽生長因子，是神經(jīng)營養(yǎng)因子(NT)家族的典型代表。本研究應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選NGF誘發(fā)PC12細胞分化的相關(guān)蛋白，旨在尋找NGF信號轉(zhuǎn)導過程的新成員，為深入進行神經(jīng)保護藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫，DMEM購自Gibco公司，NGF購自廈門北大之路生物工程有限公司。尿素、硫脲、CyDye熒光標記物(Cy2，Cy3，Cy5)、賴氨酸、24 cm固相pH梯度干膠條pH3-10NL、甘油、SDS、IAA等均購自GE Healthcare-Biosciences公司。Ultrospec 3300 pro分光光度計、Ettan DALT Six電泳系統(tǒng)、Typhoon 9400系列多功能激光掃描成像系統(tǒng)以及基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)均由GE Healthcare-Biosciences公司提供。

1.2 NGF誘導PC12細胞分化晚期模型的建立 DMEM培養(yǎng)基中含體積分數(shù)為10%新生牛血清、1%谷氨酰胺、100μg/ml青霉素、100μg/m l鏈霉素，PC12細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長至90%接觸時進行傳代，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗研究。

將細胞按1×105個/ml密度接種，實驗組中加入50 ng/ml NGF、對照組中加入等體積培養(yǎng)液。給藥后96 h進行吖啶橙和溴化乙啶染色，觀察細胞形態(tài)變化，并計數(shù)分化的細胞(每孔隨機計數(shù)300個細胞，其中突起的長度超過胞體直徑2倍者計為陽性，長出多個突起的細胞只計數(shù)1次，至少計數(shù)3個孔)。

1.3 蛋白質(zhì)組學分析和差異蛋白質(zhì)的鑒定 選取四批不同代數(shù)的細胞，設(shè)為實驗組(T1～4)和對照組(C1～4)，實驗組中加入50 ng/m l NGF、對照組中加入等體積培養(yǎng)液，再培養(yǎng)96 h。收取細胞蛋白質(zhì)，純化后定量。T1～4、C1～4各取50μg分別放入8個離心管中;再取T1～4、C1～4各25μg制成內(nèi)標。如表1所示進行分組，分別以1μl CyDye(Cy3、5)工作液標記相應(yīng)的蛋白樣品，用4μl Cy2工作液標記內(nèi)標。分組后，按既定程序進行雙向電泳，然后進行凝膠圖像掃描與分析。

表1 樣品分組及內(nèi)標構(gòu)成

同樣的方法進行制備膠的電泳，然后應(yīng)用考馬斯亮藍染色及MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀進行蛋白質(zhì)的鑒定。

2 結(jié)果

2.1 NGF作用96 h PC12細胞的形態(tài)學變化 見圖1。NGF作用后觀察PC12細胞形態(tài)學的變化，并與對照組進行比較。NGF作用96 h后，細胞變得扁平，呈梭形或多角形，胞體增大，48%的細胞長出長突起，不同細胞的突起可連接成網(wǎng)。顯微鏡下細胞計數(shù)，NGF作用96 h后實驗組陽性細胞約占細胞總數(shù)的48%，相應(yīng)對照組陽性細胞約占2.4%。

圖1 對照組與NGF處理組PC12細胞的形態(tài)(吖啶橙和溴化乙啶染色，×200)

2.2 NGF誘導96 h的差異蛋白質(zhì)組分析 雙向電泳之后，實驗組和對照組的蛋白質(zhì)斑點分布模式基本一致，所獲12張蛋白質(zhì)膠圖平均含有(2 234±76)個點。以Cy2圖像為標準，與其他各圖譜相匹配，匹配率約為88.1%。用軟件分析NGF誘導PC12細胞分化晚期(96 h)的蛋白質(zhì)表達，發(fā)現(xiàn)實驗組與對照組相比有58個蛋白點表達量顯著改變，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定，獲得其中10個蛋白質(zhì)的明確質(zhì)譜信息，見圖2、圖3及表2。其中NF-M、NF-L、α-tubulin 2、tubulin β-15、annexin Ⅴ、TM 等 6 個蛋白表達上調(diào)，而VCP、TH、RNA解旋酶、GST等4個蛋白表達下調(diào)。如圖2A所示點d的5個蛋白質(zhì)點分子量相當，等電點間隔相同，而且各點的質(zhì)譜鑒定結(jié)果完全一致，提示這一列蛋白點為發(fā)生不同程度修飾的同一蛋白。

圖2 NGF誘導PC12細胞96 h的蛋白質(zhì)組學分析圖譜

圖3 蛋白點h的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果

表2 NGF作用96 h后差異表達蛋白的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

3 討論

蛋白質(zhì)組學技術(shù)的關(guān)鍵在于蛋白質(zhì)的分離和鑒定，二維電泳(2DE)是目前分離蛋白質(zhì)的主要手段，但是傳統(tǒng)的2DE技術(shù)靈敏度較低，結(jié)果可靠性、重復性較差。DIGE技術(shù)〔1〕在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重熒光分析的方法，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，極大地提高了結(jié)果的準確性、可靠性和重復性，被認為是目前定量蛋白質(zhì)組學研究中可信度和準確率最高的技術(shù)之一。

本實驗中，NGF作用PC12細胞96 h后，共發(fā)現(xiàn)58個表達量變化的蛋白點，質(zhì)譜獲得其中10種蛋白質(zhì)的明確信息。其中有5種結(jié)構(gòu)蛋白，即 NF-M、NF-L、α tubulin-2、tubulinβ-15和TM，他們的表達均增高，參與構(gòu)成微管、微絲及中間絲蛋白等細胞結(jié)構(gòu)。

蛋白點 b為含纈酪肽蛋白(valosin-containing protein，VCP)，是三磷酸腺苷酶超家族中的一員，又稱黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白或p97。VCP的底物多樣〔2〕，包括有絲分裂的細胞周期蛋白以及細胞周期蛋白激酶抑制劑p27、原癌基因產(chǎn)物p53、c-myc、c-Jun、I-κB等。因而VCP在膜融合、細胞分裂周期調(diào)控、細胞內(nèi)蛋白的運輸和調(diào)控以及細胞凋亡等活動中均發(fā)揮著重要作用。

蛋白點d被鑒定為TH，該酶是兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)合成過程中的限速酶，催化酪氨酸轉(zhuǎn)變成L-多巴，膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能夠誘導中腦源干細胞表達TH〔3〕。有報道顯示，低濃度(1μg/ml)NGF作用早期，交感神經(jīng)元內(nèi)TH水平下降，此時NGF主要通過細胞表面受體促使軸突的形成;而高濃度NGF(100μg/ml)則通過神經(jīng)末梢攝取和軸突的逆向轉(zhuǎn)運到達胞體，誘導TH表達和細胞生存〔4〕。本實驗應(yīng)用的NGF濃度為50 ng/ml，遠遠低于引起TH表達所需的NGF濃度，推測這是TH表達下調(diào)的主要原因。

經(jīng)質(zhì)譜鑒定，蛋白點h為膜聯(lián)蛋白Ⅴ。膜聯(lián)蛋白具有抑制磷脂酶A2及蛋白激酶C活性、參與細胞骨架活動、參與磷脂化與膜受體的功能調(diào)節(jié)、抗凝、傳導有絲分裂信號以及促進細胞分泌等重要生理功能〔5〕。本研究中實驗組的膜聯(lián)蛋白Ⅴ表達顯著增高，其在NGF誘導PC12細胞分化過程中的具體作用還需進一步探索。

蛋白點g經(jīng)質(zhì)譜鑒定證實為RNA解旋酶，此酶能夠使雙鏈RNA解鏈，作用于RNA-蛋白復合體使其中RNA解離。細胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄、加工剪接及核糖體組裝都需要解旋酶的參與〔6〕。本實驗在NGF誘導PC12細胞分化的蛋白質(zhì)組學研究中檢測到RNA解旋酶的表達降低35%。推測此時ATP水解耗能減少，以節(jié)約能量用于細胞分化過程。

點j為GST Y-b亞單位，GST是細胞抗損傷、抗癌變的重要解毒酶系，主要催化還原型谷胱甘肽(GSH)與親電子化合物的結(jié)合，使后者失去結(jié)合DNA的活性，在代謝環(huán)境致癌物和化療藥物中發(fā)揮重要作用〔7〕。在本實驗中，檢測到GST含量降低，這可能與NGF誘導的PC12細胞分化過程有關(guān)。

綜上所述，本研究應(yīng)用DIGE技術(shù)結(jié)合MALDI-TOF質(zhì)譜分離鑒定了一批在NGF處理的PC12細胞中表達發(fā)生顯著改變的蛋白。這些蛋白可能是NGF信號轉(zhuǎn)導過程的新成員，也可以成為藥物治療的新靶點。

1 Yan JX，Devenish AT，Wait R，etal.Fluorescence two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry based proteomic analysis of Escherichia col〔i J〕.Proteomics，2002;2(12):1682-98.

2 Partridge JJ，Lopreiato JO Jr，Latterich M，et al.DNA damage modulates nucleolar interaction of the Werner protein with the AAA ATPase p97/VCP〔J〕.Mol Biol Cell，2003;14(10):4221-9.

3 姜 宇，曾水林，魯佑瑜，等.膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進中腦源神經(jīng)干細胞增殖和向多巴胺能神經(jīng)元分化〔J〕.神經(jīng)解剖學雜志，2010;26(5):537-42.

4 Hill CE，Hendry IA.Differences in sensitivity to nerve growth factor of axon formation and tyrosine hydroxylase induction in cultured sympathetic neurons〔J〕.Neuroscience，1976;1(6):489-96.

5 劉 懿，凌詒萍，鐘慈聲.annexin鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白在細胞分泌中的作用〔J〕.生理科學進展，1997;4:367-9.

6 Luking A，Stahl U，Schmidt U.The protein family of RNA helicases〔J〕.Crit Rev Biochem Mol Biol，1998;33(4):259-96.

7 Yang G，Shu XO，Ruan ZX，et al.Genetic polymorphisms in glutathione-S-transferase genes(GSTM1，GSTT1，GSTP1)and survival after chemotherapy for invasive breast carcinoma〔J〕.Cancer，2005;103(1):52-8.

Q503

A

1005-9202(2011)12-2267-03

1 吉林大學第二醫(yī)院兒科 2 長春市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

3 吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

胡林森(1949-)，男，教授，博士生導師，從事神經(jīng)變性病的機制研究。

侯 澍(1978-)，女，醫(yī)師，博士，從事神經(jīng)系統(tǒng)血管性疾病的機制和治療研究。

〔2010-10-20收稿 2011-02-25修回〕

(編輯 徐 杰)