FKN對外周血單個核細胞ERK1/2活化和TNF-α表達的影響及ERK1/2的臨床作用

雷明明 孫 健 張學穎 金元哲 (中國醫科大學附屬第四醫院心內科，遼寧 沈陽 0032)

FKN對外周血單個核細胞ERK1/2活化和TNF-α表達的影響及ERK1/2的臨床作用

雷明明 孫 健1張學穎 金元哲 (中國醫科大學附屬第四醫院心內科，遼寧 沈陽 110032)

目的 探討趨化因子(FKN)對單個核細胞細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)1/2和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)表達的影響及ERK1/2在其中的作用。方法 抗凝血用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞。將每份提取的單個核細胞分為3組:空白對照組、FKN組、FKN+PD98059(ERK特異性阻斷劑)組;分別應用Western印跡法和酶聯免疫法檢測各組單個核細胞中磷酸化ERK1/2及TNF-α的表達水平。結果 FKN誘導組磷酸化的ERK1/2和TNF-α表達較空白組顯著增多(P＜0.05);PD98059組磷酸化的ERK1/2和TNF-α表達較FKN組顯著減少(P＜0.05)。結論 FKN-CX3CR1可能通過增加單個核細胞磷酸化ERK1/2和TNF-α的表達而促進動脈粥樣硬化的進展，FKN可能是通過ERK1/2途徑誘導單個核細胞TNF-α的表達。

動脈粥樣硬化;FKN;ERK1/2;腫瘤壞死因子

最近發現炎性內皮細胞釋放一種新的趨化因子(fractalkine，FKN)，與自然殺傷(NK)細胞、單核細胞、淋巴細胞上的受體趨化因子(CX3CR1)結合以后，可以增強NK細胞的殺傷力，導致血管內皮細胞損傷;同時使單核細胞、淋巴細胞向血管內皮細胞趨化、黏附，從而促進動脈粥樣硬化(AS)的形成。目前，關于此趨化因子信號傳導機制尚不清楚，還沒有實驗證實FKN/CX3CR1系統引發的細胞內分子水平反應。本實驗針對FKN/CX3CR1引發的細胞內信號傳導機制研究FKN-CX3CR1、細胞外信號通路1/2(ERK1/2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之間的上下游關系，并探討ERK1/2在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人外周血濃縮白細胞、低糖DMEM(LGDMEM，Gibco)，優等胎牛血清(FBS，Hyclone)，Ficoll分離液(濃度1.077 g/ml，Pharmacia)，胰酶、乙二胺四乙酸(EDTA)(Promega)，兔抗人磷酸化ERK1/2單克隆抗體(R＆D Systems)，山羊抗兔抗體(IgG，Santa Cruz)，人TNF-αELISA定量檢測試劑盒(北京博蕾德生物科技有限公司)，重組人FKN(PeproTech Inc)，ERK特異性阻斷劑PD98059(ALEXIS)，兔抗β-tubulin抗體(Santa Cruz)，化學熒光劑(ECL)試劑盒(上海國藥集團化學試劑有限公司生命科學部)。

1.2 方法

1.2.1 分離人外周血單個核細胞 無菌條件，Ficoll密度梯度離心法從人外周濃縮白細胞中分離人單個核細胞。

1.2.2 Western印跡方法檢測單個核細胞磷酸化ERK1/2的含量 Ficoll密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞(PBMC)并計數后，將1×107個單個核細胞(2 m l)/孔鋪于六孔板中，實驗分組如下:①空白對照組:單個核細胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養箱中孵育2 h后，加入FKN溶媒對照，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育45 min。②FKN組:在單個核細胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養箱中孵育2 h后，加入 FKN(終濃度為0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養箱中孵育45 min。③FKN+PD98059組:在單個核細胞中加入PD98059(終濃度為50 μmol/L)，37℃、5%CO2培養箱中孵育2 h后，加入 FKN(終濃度為 0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養箱中孵育45 min。按照常規Western印跡方法對上述各組ERK1/2和β-tubulin進行檢測。結果判定:磷酸化ERK1/2相對積分光密度值=磷酸化ERK1/2條帶積分光密度值/β-tubulin條帶積分光密度值。

1.2.3 ELISA方法檢測單個核細胞培養上清中TNF-α含量

1.2.3.1 分組 用含10%FBS的RPMI1640培養液調整人外周血單個核細胞濃度至5×106個單個核細胞/m l，接種于96孔板中，每孔200μl，實驗分為3組，每組2個復孔:①空白對照組:單個核細胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養箱中孵育2 h后，加入FKN溶媒對照，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h。②FKN組:在單個核細胞中加入抑制劑溶媒對照，37℃、5%CO2培養箱中孵育2 h后，加入FKN(終濃度為0.5μg/m l)，37℃、5%CO2培養箱中孵育 24 h。③FKN+PD98059組在單個核細胞中加入 PD98059(終濃度為50 μmol/L)，37℃、5%CO2培養箱中孵育 2 h后，加入 FKN(終濃度為 0.5 μg/ml)，37℃、5%CO2培養箱中孵育24 h。

1.2.3.2 ELISA法檢測各組培養上清中TNF-α含量 收集各組單個核細胞的培養上清，按免疫酶標試劑盒說明書操作:①標準品配制:取標準品1支加500μl標準品液，混勻，全部吸出加入另一支標準品中(A:500 pg/ml)，取1 m l小離心管7支(B、C、D、E、F、G、H)，分別加入250 μl標準品液，H 管為零對照管，從A管吸取250μl加入B管，混勻(B:250 pg/ml)，依次倍比稀釋至 G 管(C:125 pg/ml，D:62.5 pg/m l，E:31.25 pg/ml，F:15.6 pg/ml，G:7.8 pg/ml，H:0 pg/m l)。②加樣:樣品孔，每孔加100μl血清;標準品孔，每孔加100μl標準品，均做2復孔，37℃2 h。③洗板:300μl/孔1×清洗液，甩去，在干凈的吸水紙上拍干。如此洗3遍。④加檢測抗體:100μl/孔，37℃2 h，洗板同③，洗4遍。⑤加酶結合物:100μl/孔，37℃ 30 min。洗板同③，洗5遍。⑥顯色:顯色液A 50μl/孔，顯色液B 50μl/孔(先加A液再加B液，不得先加B液，也可等量的A液與B液混合，100μl/孔)，37℃ 30 min(從加B液算時間)。⑦終止:終止液100μl/孔，按顯色液加樣順序加樣。⑧測值:測定各孔450 nm的OD值。⑨繪制標準曲線:以標準品濃度值(pg/ml)為橫坐標，以所測標準品的OD值為縱坐標。利用各樣品孔測得的OD值，從標準曲線上查相應的濃度值，以pg/ml表示。

1.3 統計學方法 應用SPSS15.0統計軟件進行處理，實驗數據以±s表示，采用Bartlett法證明各組方差齊性后，采用方差分析和Newman-Keuls-q檢驗進行組間兩兩比較。

2 結果

2.1 Western印跡檢測單個核細胞內ERK1/2表達 各組細胞內均有磷酸化ERK1/2的表達，FKN組與空白組相比，條帶顏色明顯加深，光密度值增加(1.811 2±0.068 2 vs 0.723 0±0.110 2)，差異有統計學意義(P＜0.05)。PD98059組磷酸化的ERK條帶較FKN組顏色有不同程度變淺，光密度值(1.287 6±0.082 8)減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 W estern印跡檢測各組單個核細胞內ERK 1/2表達

2.2 ELISA法檢測 TNF-α表達結果 FKN刺激24 h后，TNF-α 表 達 〔(206.686 1 ± 7.979 0)pg/m l〕較 空 白 組〔(112.159 6±7.366 2)pg/ml〕增加，差異有統計學意義(P＜0.05);應用PD98059預刺激2 h后，再加入FKN孵育24 h組TNF-α 表達〔(63.894 7±1.577 3)pg/m l〕較FKN 組減少，差異有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

3.1 FKN-CX3CR1對AS的影響及其機制 FKN是新發現的一種在AS斑塊中過量表達的趨化因子，在AS形成過程中參與炎癥反應，用膜結合型FKN刺激NK細胞，或FKN表達細胞與NK細胞共培養可誘導干擾素 γ(IFN-γ)表達〔1〕，而且 FKN能與新分離的NK結合，以劑量依賴的方式增強NK的殺傷力，從而導致內皮細胞損傷〔2〕，同時 FKN可以介導表達其受體CX3CR1的單核細胞、淋巴細胞、血管平滑肌細胞(VSMC)等向損傷的血管內皮細胞黏附、趨化，并能跨越血管壁向血管外特定部位遷移，FKN還可以促進血小板的活化，Barlic等發現氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)和氧化型亞油酸以FKN濃度依賴的方式誘導單核細胞與冠狀動脈VSMC的異常黏附〔3〕，從而在AS的進展中發揮作用。Ikejima等人發現，FKN-CX3CR1的表達可能導致冠狀動脈粥樣斑塊的破裂〔4〕。.因此，FKN被認為是AS的危險因素之一。經實驗證明，趨化因子FKN介導的促白細胞黏附過程并不需要其他黏附分子，其可通過與受體CX3CR1結合兼有介導細胞黏附與趨化的功能〔5，6〕。

目前，還沒有實驗確切證實FKN/CX3CR1系統引發怎樣的細胞內分子水平反應，繼而促進AS的形成。TNF對血管內皮細胞可產生直接細胞毒作用〔7〕，從而破壞內皮細胞結構和功能的完整性，致內皮細胞大片脫落，造成血管內皮細胞損傷，導致內皮細胞分泌活性物質平衡失調，內皮素(ET)合成和釋放增多。通過以上可以看出，TNF-α可能在AS形成中發揮著很重要的作用。經實驗發現，FKN處理組TNF-α表達值較空白組顯著增高。說明FKN可使單個核細胞TNF-α表達增加，推測FKN-CX3CR1促進AS形成的機制之一可能是通過增加單個核細胞TNF-α表達而實現的。

研究表明ERK通路的激活與應激刺激、細菌產物、炎癥介質等引起的細胞反應亦存在著密切關系。ERK分子所涉及的通路在心肌細胞中具有重要作用，不僅涉及心肌細胞的信號傳導、生長等生理過程，與心肌細胞的肥厚和凋亡等病理過程也密切相關。Hu等〔8〕發現，球囊損傷后早期血管組織ERKl/2活性升高，同時伴有c-fos和c-jun的mRNA的升高;在損傷后7～14 d，內膜的 ERK1/2仍然升高，并且內膜高于中膜，提示ERK1/2活性和兩種癌基因表達的增加可能參與了再狹窄過程;Yang等〔9〕報道，ox-LDL在導致培養 VSMC增殖的同時，伴隨促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)的活化，并可誘導ERKl/2的活化?？梢钥闯?，ERK可能在AS形成中發揮著很重要的作用。實驗發現，FKN處理組磷酸化ERK1/2含量較空白組顯著增加。結果說明FKN可使單個核細胞磷酸化ERK1/2表達增加，推測FKN-CX3CR1促進AS形成的機制之一可能是通過增加單個核細胞表達磷酸化ERK1/2而實現的。

3.2 ERK1/2在FKN-CX3CR1影響AS信號傳導機制中的作用 研究證實，CX3CR1屬于G-蛋白耦聯受體〔10〕。目前國內外大量試驗已經明確證實:G-蛋白能將與其耦聯的受體與其相應效應酶如:蛋白激酶A、蛋白激酶C、磷脂酶C等聯結起來，進而通過效應酶產生相應的生物學效應。許多研究表明PKC可以通過 Ras途徑和 PI3K途徑激活 ERK(MAPK)，但 FKNCX3CR1是否可以通過上述途徑，即通過激活PKC而促進ERK的活化呢?此前的研究表明，FKN-CX3CR1可以通過G-蛋白與PKC相耦聯后，誘導單個核細胞核轉錄因子(NF-κB)和TNF-α的表達〔10〕，從而促進 AS的形成。以上實驗結果說明 FKN/CX3CR1-G蛋白-PKC-ERK之間可能存在一系列的級聯反。

磷酸化激活的ERKl/2可調節某些轉錄因子的活性，進一步調節它們各自靶基因的轉錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，最終調節細胞代謝和功能，影響細胞產生特定的生物學效應。除此之外，還可以調節NF-κB和轉錄激活蛋白-1(Ap-1)等轉錄因子的轉錄活化，活化的NF-κB可通過調節各種黏附分子、炎性分子及趨化因子而在AS的形成中發揮作用。本實驗應用ERK抑制劑PD98059來阻斷ERK作用，研究探討ERK和TNF-α之間的關系，也即ERK信號途徑是否參與了FKN誘導引起的單個核細胞內信號傳導機制。實驗結果發現:PD98059組TNF-α表達值較FKN組明顯減少。PD98059組與空白組比較，TNF-α的濃度亦明顯減少。結果說明，ERK在 FKNCX3CR1誘導單個核細胞表達TNF-α的過程中發揮極其重要的作用，阻斷ERK后，TNF-α的濃度明顯減少。結合此前的實驗研究，推測:FKN-CX3CR1系統可能通過 G-蛋白與效應酶PKC偶聯，活化后的PKC使ERK磷酸化，后者活化后進入細胞核，直接調節或者通過影響特定的轉錄因子，如NF-κB而間接的影響單個核細胞對TNF-α表達，最終促進AS的形成和發展。

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3 Barlic J，Zhang Y，Murphy PM.Atherogenic lipids induce adhesion of human coronary artery smoothmuscle cells tomacrophages by up-regulating chemokine CX3CL1 on smoothmuscle cells in a TNFα-NFκB-dependent manner〔J〕.JBiol Chem，2007;282(26):19167-76.

4 Ikejima H，Imanishi T，Tsujioka H，et al.Upregulation of fractalkine and its receptor，CX3CR1，is associated with coronary plaque rupture in patientswith unstable angina pectoris〔J〕.Circ J，2010;74(2):337-45.

5 Imai T，Hieshima K，Haskell C，etal.Identification andmolecular characterization of fractalkine receptor CX3CR1，which mediates both leukocyte migration and adhesion〔J〕.Cell，1997;91(4):521-30.

6 Umehara H，Bollm ET，Okazaki T，et al.Fractalkine and vascular injury［J］.Trends Immunol，2001;22(8):602-7.

7 Schger L，Varahi J，Marks RM，et al.Cytotoxicity of tumor necrosis factorα for human umbilical vein endothelial cells〔J〕.lab Invest，1989;61(11):62-8.

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10 孫 健，李淑梅，鄭柳穎，等.FKN影響動脈粥樣硬化信號傳導機制及G蛋白在其中作用的研究〔J〕.中國老年學雜志，2007;27(6):533-5.

R541.4

A

1005-9202(2011)12-2264-03

吉林省科技發展計劃項目資助(2007052351)

1 吉林大學第一醫院心內科

金元哲(1965-)，男，教授，主任醫師，主要從事心臟病介入治療的研究。

雷明明(1982-)，男，碩士，醫師，主要從事冠心病基礎研究。

〔2011-04-11收稿 2011-04-22修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)