蒺藜皂苷對老年癡呆小鼠腦組織中H2 O2、CAT、GSH-Px含量及海馬超微結構的影響

張 季 嚴春臨 張丹參 張 力 安 芳 侯 勇 (河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

蒺藜皂苷對老年癡呆小鼠腦組織中H2O2、CAT、GSH-Px含量及海馬超微結構的影響

張 季 嚴春臨 張丹參 張 力 安 芳 侯 勇 (河北北方學院藥學系，河北 張家口 075000)

目的 研究蒺藜皂苷對凝聚態β-淀粉樣肽(Aβ25～35)致衰老小鼠腦組織中過氧化氫(H2O2)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化氫酶(GSH-Px)含量及海馬超微結構的影響。方法 采用一次性小鼠右側腦室注射Aβ25～353μl造成AD小鼠模型，并于側腦室注射后14 d測定各組小鼠腦組織中H2O2的含量、CAT、GSH-Px的活力并于光鏡、電鏡下觀察小鼠大腦皮質及海馬組織超微結構。結果 側腦室注射Aβ25～353μl后可引起小鼠腦組織內H2O2含量增加，同時使小鼠腦組織內CAT和GSH-Px活力顯著降低，而連續蒺藜皂苷14 d治療后，與模型組相比蒺藜皂苷150 mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，蒺藜皂苷450 mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01);光鏡下觀察結果顯示正常對照組海馬CA1區神經元密集、神經元結構正常;模型組神經元間隙加大，說明有輕度水腫，部分神經元核、質界限模糊，細胞嗜酸性增強;電鏡下觀察結果顯示正常對照組神經元、神經纖維超微結構正常;模型組神經元輕度水腫，脂褐素樣包含物增多，線粒體減少或消失;蒺藜皂苷各治療組可不同程度的減輕上述病理學改變。結論 側腦室注射Aβ25～35可引起小鼠大腦自由基增加，海馬超微結構改變，蒺藜皂苷能明顯改善衰老小鼠大腦組織的超微結構并呈劑量效應關系。

蒺藜皂苷;阿爾茨海默病;β-淀粉樣肽;自由基;超微結構

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性中樞神經系統退行性疾病，主要病理特征為大腦萎縮、腦組織內出現老年斑(SP)、腦血管沉淀物、神經元纖維纏結(NFT)和神經元的丟失〔1〕。近年，越來越多的研究發現β-淀粉樣肽(Aβ)在腦內沉積形成SP是AD的發病基礎〔2〕。蒺藜皂苷(GSTT)是蒺藜果實中提取的甾體皂苷的總稱，GSTT具有治療心腦血管疾病、增強性功能、清除自由基等作用〔3，4〕。近期研究表明 GSTT 對 Aβ25～35所導致癡呆小鼠的學習記憶障礙有明顯的改善作用〔5〕，GSTT是否通過清除癡呆小鼠腦內多余自由基起作用，是否能改善癡呆小鼠海馬組織超微結構病變目前均尚未見報道。本研究采用一次性在小鼠右側腦室注射3μl Aβ25～35造成AD小鼠模型，觀察癡呆小鼠腦內自由基的變化及海馬神經元超微結構的改變，初步探討GSTT治療AD的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康、昆明種雄性小鼠，體重(28±2)g，由中國醫學科學院實驗動物中心提供。全部動物在實驗室適應性飼養3 d后用于實驗，分籠飼養，自由飲食和飲水。室溫(20±2)℃。

1.1.2 藥品與試劑 GSTT購自西安天一生物技術有限公司，批號T20060901，含量90.12%，GSTT為棕黃色粉末，可溶于水，用前用蒸餾水配制成所需濃度。Aβ25～35購自美國Sigma公司，批號 29H49501，凝聚態 Aβ25～35的制備:將 1.0 mg Aβ25～35溶解于1.0 ml的無菌生理鹽水中(1.0 mmol/L)，密封后置于37℃培養箱中孵育1 w，使其成凝聚態，于 －20℃保存，備用〔6，7〕。過氧化氫酶(CAT)試劑盒、過氧化氫(H2O2)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。戊二醛、鋨酸、環氧樹脂(Epon-812)、甲基鈉迪克酸酐(MNA)等均為化學純。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥 昆明種雄性小鼠75只，隨機為5組，分別為生理鹽水對照組(正常對照組);Aβ(模型組);GSTT 50、150和450 mg/kg組。模型組和GSTT各治療組于小鼠右側腦室一次性注射Aβ25～353.0μl(3 nmol)，正常對照組注入等量生理鹽水〔8，9〕。于造模后1 h給藥，GSTT各治療組腹腔注射相應劑量的GSTT(0.1 m l/10 g);正常對照組及模型組0.1 m l/10 g生理鹽水(NS)，每日1次，共14 d。

1.2.2 小鼠腦組織生化指標的測定 第14天給藥后1 h將小鼠迅速斷頭處死，取腦，制成10%腦勻漿，然后將制備好的腦勻漿以3 000 r/min離心10 min，取上清液適量，按照試劑盒說明書分別測定H2O2的含量、CAT、GSH-Px的活力，采用考馬斯亮藍法測定腦組織蛋白含量。

1.2.3 病理實驗 另取50只健康、昆明種雄性小鼠，體重(28±2)g，分組、給藥同前，第14天給藥后1 h將小鼠快速斷頭處死，在生理鹽水冰塊上迅速打開顱骨取腦，將腦膜和小腦剝離，保留大腦，用冷生理鹽水沖洗，用于光鏡和電鏡觀察。

1.3 統計學處理 數據采用SPSS13.0統計軟件進行處理，結果以±s表示，組間顯著性差異采用單因素方差檢驗。

2 結果

2.1 GSTT對 Aβ25～35所致小鼠腦組織 H2O2含量、CAT和GSH-Px活力的影響 側腦室注射Aβ25～353μl后可引起小鼠腦組織內H2O2含量增加，同時使小鼠腦組織內CAT和GSH-Px活力顯著降低，而連續GSTT 14 d治療后，與模型組相比GSTT 50 mg/kg降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性無顯著性差異(P＞0.05)。GSTT 150 mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px活性(P＜0.05)，GSTT 450mg/kg治療組可顯著降低H2O2含量、提高CAT和GSH-Px的活性(P＜0.01)。見表1。

2.2 GSTT對Aβ25～35所致小鼠腦組織神經病理形態的影響光鏡觀察石蠟切片HE染色正常對照組海馬CA1區神經元密集，由4～6層神經細胞組成，神經元核圓形，核仁大而清晰，異染色質少，胞質較少，突起不明顯;模型組神經元間隙加大，說明有輕度水腫，部分神經元核、質界限模糊，細胞嗜酸性增強;GSTT各治療組神經元水腫減輕，細胞邊界清晰。見圖1。

電鏡觀察正常對照組神經元核大、圓，核仁多，核膜清晰，核間隙均勻，異染色質少，常染色質呈絮狀，胞質中有豐富的線粒體、粗面內質網、核糖體等，未見脂褐素樣次級溶酶體，有髓神經纖維，髓鞘結構清晰;模型組神經元輕度水腫，局部質膜消失，核內異染色質相對增多，核仁少，電子密度降低，胞質中細胞器減少，內質網擴張呈不規則泡狀，脂褐素樣包含物增多，線粒體減少或消失;GSTT 50 mg/kg治療組細胞核有不規則的凹陷，胞質中細胞器增多，脂褐素仍較常見;GSTT 150 mg/kg治療組核仁可見，核邊界稍有不規則，細胞器增多;GSTT 450 mg/kg治療組神經元核大、圓，核仁明顯，邊界清晰，細胞器豐富，線粒體、粗面內質網、核糖體均可見到，有的細胞中仍有脂褐素顆粒，神經纖維結構正常。見圖2。

圖1 光鏡下，各組的超微結構(HE染色，×100)

圖2 電鏡下，各組的超微結構(釉-鉛染色，×10 000)

表1 GSTT對Aβ25～35模型小鼠腦組織H 2O2含量和CAT、GSH-Px活性的影響(±s，n=15)

表1 GSTT對Aβ25～35模型小鼠腦組織H 2O2含量和CAT、GSH-Px活性的影響(±s，n=15)

與對照組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 劑量(mg/kg)H2O2(mmol/L)CAT(U/mgprot)GSH-Px(U/mgprot)正常對照組1.03±0.24 6.15±1.26 31.51±5.72模型組 1.33±0.251) 4.58±1.171) 22.77±5.641)GSTT組 50 1.23±0.18 4.64±1.32 24.28±4.77 GSTT組 150 1.14±0.212) 5.49±1.192) 27.33±5.732)GSTT組 450 1.09±0.193) 5.88±1.213) 29.36±5.583)

3 討論

AD最主要的病理改變為SP和NFT，神經細胞淀粉樣前體蛋白(APP)可在γ-分泌酶作用下裂解產生Aβ，Aβ是引起腦組織形成不溶性淀粉樣沉積的重要物質，也是腦組織淀粉樣斑塊中的主要成分，側腦室內一次性注射可溶性大片段Aβ可部分的模擬出AD臨床表現〔7〕。Aβ增高不但能引起斑塊沉積，Aβ亦具很強的陽性物質還原作用，可迅速還原Ca2+和Fe2+，捕獲分子氧，產生H2O2，導致氧化應激反應，使超氧化物歧化酶(SOD)降低，丙二醛(MDA)上調，誘導神經細胞的凋亡或死亡〔8〕。過氧化物又可使溶解狀態下Aβ的轉化為聚集態的Aβ，加速腦內的沉積和纏結，從而形成惡性循環〔9〕。本實驗結果表明模型組AD小鼠腦組織內H2O2含量明顯升高，對小鼠造成一定的損傷，而GSTT可有效對抗小鼠腦內H2O2升高，其機制可能與GSTT減少淀粉樣沉積、加速斑塊的清除、提高AD小鼠腦內各種過氧化物酶(如CAT、GSH-Px)的活力，降低小鼠腦內各種自由基，從而減少Aβ25～35所誘導的自由基損傷和細胞毒作用有關有關，GSTT對AD小鼠的保護作用是否與其他過氧化物酶活力提高有關，還有待進一步研究。本實驗還觀察到:GSTT 50 mg/kg和150 mg/kg劑量組對海馬神經細胞超微結構的保護作用均不明顯;GSTT 450 mg/kg組對海馬超微結構顯示出明顯的保護作用。GSTT各組隨劑量增加，對海馬超微結構的保護作用增強。因此GSTT能保護Aβ老化模型小鼠海馬超微結構的正常，其作用可能通過清除自由基或增強自由基清除酶的活性，抑制膜脂質過氧化機制起到保護海馬神經細胞超微結構的作用，從而達到延緩衰老和防治老年性癡呆，因此GSTT有可能成為治療AD的一種新藥，有廣泛的應用前景。

1 王德生，張守信.老年性癡呆〔M〕.北京:人民衛生出版社，2001:397.

2 鄧海平，沈雪勇，丁光宏.Alzheimer病β-淀粉樣蛋白神經毒性機制的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2004;24(1):73-4.

3 李 穆，褚書地，瞿偉菁，等.蒺藜化學成分及其藥理作用研究進展〔J〕.中國野生植物資源，2003;22(4):4-7.

4 孫少敏，張維君，楊晶，等.刺蒺藜對衰老小鼠的紅細胞SOD活性和MDA含量的影響〔J〕.黑龍江醫藥科學，2000;23(1):5.

5 張 季，張丹參，嚴春臨，等.蒺藜皂苷對小鼠記憶障礙的影響〔J〕.中藥藥理與臨床，2007;23(3):47-9.

6 徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實驗方法學〔M〕.第3版.北京:人民衛生出版社，2005:184.

7 楚 晉，李 林.腦室灌注β淀粉樣肽致癡呆動物模型〔J〕.中國藥理學通報，2004;20(7):827-9.

8 張孟仁，郭賽珊，左萍萍，等.β淀粉樣肽損傷后小鼠腦單胺氧化酶B、白細胞介素-6的變化及中藥的干預作用〔J〕.中國康復理論與實踐，2005;11(5):327-9.

9 Huang X，Atwood CS，Hartshorn MA，et al.The beta-peptide of Alzheimer's disease directly produces hydrogen peroxide through metal ion reduction〔J〕.Biochemistry，1999;38(24):7609-16.

R965.1

A

1005-9202(2011)12-2258-03

張丹參(1961-)，女，教授，博士生導師，主要從事神經藥理學研究。

張 季(1978-)，女，碩士，講師，主要從事中藥藥理學研究。

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〔2010-06-29收稿 2011-01-04修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)