20(S)-原人參二醇對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

冷吉燕 李麗新 張 婧 秦俊杰 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

20(S)-原人參二醇對人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響

冷吉燕 李麗新 張 婧 秦俊杰 (吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

目的 探討20(S)-原人參二醇(Ppd)對胃癌細胞SGC-7901細胞周期的影響。方法 采用MTT法檢測Ppd對SGC-7901細胞存活率的影響，流式細胞分析法檢測凋亡小體的含量。結果 Ppd對SGC-7901細胞生長有明顯的抑制作用，且呈量-效關系;IC50為2.0μg/ml;且腫瘤細胞產生明顯的G1期阻滯現象，Ppd 2.0μg/ml時G1細胞百分率達76.08%，而在Ppd 10.0μg/ml時為81.17%，較對照組(39.02%)明顯增多(P＜0.05)，而S、G2～M期細胞數明顯減少。流式細胞術結果也證明，不同濃度的Ppd作用SGC-7901細胞后，在G1期的前面出現一個小的亞二倍體峰，即為凋亡峰，且隨著Ppd劑量增加，處于凋亡峰的細胞比例呈增加趨勢。在Ppd 2.0μg/ml時，其凋亡峰為27.58;Ppd 10.0μg/ml時，出現最大凋亡峰為28.31。結論 Ppd促進了胃癌SGC-7901細胞凋亡，抑制了胃癌SGC-7901細胞的增殖。

Ppd;胃癌;細胞凋亡;SGC-7901

20(S)-原人參二醇(Ppd)從人參、西洋參中提純，通過體內試驗、增效減毒試驗、腫瘤免疫學試驗及分子生物學試驗證實，Ppd具有良好的抗癌活性，對肝癌H22、Lewis肺癌及黑色素瘤B16均具有明顯的生長抑制作用，并可增強機體免疫力，具有提高自然殺傷細胞(NK)、白細胞介素-2(IL-2)活性的作用，但目前關于Ppd對人胃癌細胞的作用研究較少。本文旨在研究Ppd對伴有淋巴結轉移的人胃癌SGC-7901細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SGC-7901購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，噻唑藍(MTT)，美國Sigma公司;IMDM人工合成培養液，GIBCOBRL;新生牛血清，Hyclone產品;Ppd由本校有機化學教研室提供。RNA酶，Bochringe Mannheim產品;碘化丙錠(PI)，SIGMA U.S.A;流式細胞儀(ELITE型)，Coulter U.S.;AMikro 22R高速低溫離心機，Zentrifugen Germany。

1.2 細胞培養及細胞存活率的監測 細胞傳代培養于含10%小牛血清的RPMI1640培養液中，置于37℃、5%CO2孵箱，生長至對數生長期，以濃度為5×104個/m l，接種于96孔培養板，培養24 h 后，分為5 組，分別加入0.5、1.0、2、5、10 μg/ml濃度的Ppd溶液，100μl/孔，另設磷酸鹽緩沖液(PBS)為陰性對照組，各濃度設8個復孔，分別培養24 h、48 h、72 h后，每孔加入5 mg/m l的MTT 20μl，培養4 h，棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO)150μl/孔，振蕩15 min，在酶聯儀波長550 nm處測出各孔吸光度值(A)。實驗重復3次，按下列公式計算細胞生長抑制率:抑制率(%)=(1－加藥孔平均A值/對照孔平均A值)×100%，計算IC50。

1.3 細胞凋亡的檢測 25%胰酶消化傳代貼壁細胞、計數，臺盼藍染色測活細胞數為90%以上，將細胞接種于培養瓶中，每瓶5×106，同時加藥，根據Ppd濃度分為5組，分別為0.5、1.0、2、5、10 μg/m l，對照組加等體積 PBS，各濃度設 6 個復孔，每瓶終體積為4 ml，作用48 h后，收集經藥物作用后的各濃度的細胞1×106個，離心，棄上清，將細胞團吹打均勻后用70%冷乙醇4℃固定12 h以上。PBS洗2次，調整細胞濃度為1×106/ml。加入RNAase 0.5ml(5 μg/ml)，37℃消化30min，取出放入冰浴中，加入1.5 m l PI 1.5 ml(5 mg/100 ml)對DNA進行染色，用300目尼龍網過濾。上流式細胞儀，在波長為488 nm、300 mV氬離子激光條件下，每份樣品檢測1×104/m l個細胞。所得數據通過接口直接貯存在計算機上，用multicycle進行分析，以DNA含量為橫坐標，受檢細胞數為縱坐標，計算各期細胞所占比例。

1.4 統計學分析 所有數據的統計分析均在SPSS及MSExcel中進行，采用方差分析和重復測量的方差分析。

2 結果

2.1 Ppd對SGC-7901的抑制作用 從2.0μg/m l起，Ppd即對SGC-7901生長具有明顯的抑制作用，最大抑制率達到58.9%。隨著Ppd濃度的增高，對SGC-7901的抑制作用也增強，呈劑量依賴性，但增長幅度近于平臺表現。故以下均以Ppd 2.0μg/ml作為最佳抗腫瘤劑量進行實驗。見表1。

表1 Ppd對SGC-7901細胞的抑制作用(n=8)

2.2 Ppd作用后SGC-7901細胞的形態學變化 將SGC-7901細胞與不同劑量的Ppd共同孵育48 h后，光鏡下觀察，未給藥組細胞貼壁狀況良好，細胞透明，狀態佳，細胞折光性好，細胞呈棱形或多角形，鋪滿整個瓶壁。Ppd給藥組，低劑量組細胞形態不規則，細胞體積減小，細胞數目較對照組少，胞質無明顯變化。高劑量組細胞貼壁狀況不好，大部分貼壁細胞為圓形，細胞內有較多顆粒樣物質，部分細胞漂浮在培養液中，細胞數目較低劑量組明顯減少。

2.3 Ppd對SGC-7901細胞周期的影響 流式細胞儀檢查結果表明，用不同濃度的Ppd處理細胞48 h后，S、G2～M期細胞數減少，G1期細胞數明顯增多。見表2。

表2 藥物作用后SGC-7901細胞周期的變化(n=6，±s)

表2 藥物作用后SGC-7901細胞周期的變化(n=6，±s)

與對照組比較:1)P＜0.05;下表同

組別Ppd濃度(μg/ml)G2～M S G1～G0對照組0 20.35±1.9 41.20±2.8 39.02±2.2 1 0.5 7.67±0.31)14.69±3.31)77.11±3.01)2 1 4.23±1.21)23.98±4.11)74.76±4.01)3 2 2.89±0.31)17.34±2.21)76.08±5.281)4 5 6.08±0.91)17.51±1.01)80.08±6.21)5 10 4.43±0.81)18.91±2.41)81.17±4.91)

2.4 Ppd對SGC-7901細胞凋亡峰的影響 SGC-7901細胞經不同劑量的Ppd作用后，均有亞G1峰(即凋亡峰)出現，說明有部分細胞出現凋亡。對照組、0.5、1、2、5、10 μg/ml Ppd 組凋亡率分別為(0.19±0.0)、(0.27±0.1)、(6.26±1.2)、(27.58±4.8)、(27.48±4.7)、(28.31±4.9)%。相關分析顯示，Ppd劑量與凋亡發生呈正相關(P＜0.05)。

2.5 DNA瓊脂糖凝膠電泳 SGC-7901細胞在2.0、5.0μg/ml Ppd作用下，所提取的DNA在瓊脂糖凝膠電泳時出現典型的“階梯”帶，大小相當于180 bp或180 bp的整數倍，提示DNA在核小體連接時斷裂，細胞發生凋亡，而對照組無此結果。見圖1。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

細胞凋亡是一種由基因調控的細胞主動死亡過程，近年來研究表明許多抗癌藥物均能誘導腫瘤細胞發生凋亡，可能是這些藥物抑制腫瘤生長機制之一。細胞凋亡的誘導具有選擇性，不會造成周圍組織的損傷。一般抗癌藥物都可能通過誘導各自敏感腫瘤細胞凋亡來達到治療目的，但其毒副作用限制了臨床應用。選擇有效藥物調控凋亡相關基因或其相應產物，提高腫瘤細胞對抗癌藥物敏感性，誘導腫瘤細胞進入凋亡，減少對機體毒副作用，這是腫瘤治療取得成功的關鍵。細胞凋亡時DNA分解與常規壞死時DNA分解的最大不同，在于壞死時DNA的分解是隨機的，產生的DNA碎片的分子量大小不一，在電泳時形成涂片(smear);而凋亡細胞的DNA分解的特點是雙鏈DNA的斷裂點在核小體之間的聯接區。因此形成的DNA片段長度總是核心核小體亞單位DNA長度(180～200 bp)的整數倍。這樣的DNA片段在瓊脂糖電泳上形成特征性的“階梯形”〔1，2〕，常作為檢驗細胞凋亡的生化指標而被廣泛應用。細胞膜完整的活細胞對陽離子染料PI等有拒染能力，凋亡早期雖然細胞尚完整，但細胞膜轉運功能出現一過性損傷，對染料的攝取量增加，流式細胞儀檢測可呈現亞二倍體核型峰(凋亡峰)的特征，據此可區別凋亡細胞與壞死細胞。

SGC-7901細胞是伴有淋巴結轉移的人胃癌細胞，已經失去了正常的細胞凋亡功能。發現能夠誘導SGC-7901細胞凋亡的藥物，對于晚期胃癌的治療具有重要的意義。本實驗Ppd作用于SGC-7901細胞48 h后，DNA凝膠電泳上即出現明顯的DNA梯形帶，并且隨著劑量增高，條帶數清晰，說明Ppd誘導SGC-7901細胞凋亡，并與其抑制SGC-7901細胞增殖有相關性。Ppd對SGC-7901細胞周期的影響非常顯著，藥物作用后，腫瘤細胞產生明顯的G1期阻滯現象，Ppd為2.0μg/m l時，G1細胞百分率達76.08%，而在Ppd為10.0μg/m l時為81.17%，較對照組(39.02%)明顯增多，而S、G2～M期細胞數明顯減少。流式細胞術結果也證明，不同濃度的Ppd作用SGC-7901細胞后，在G1期的前面出現一個小的亞二倍體峰，即為凋亡峰，說明有部分細胞出現凋亡，在Ppd為2.0μg/ml時，其凋亡峰為27.58;Ppd為10.0μg/ml時，出現最大凋亡峰為28.31。說明隨著Ppd劑量增加，處于凋亡峰的細胞比例呈增加趨勢。Ppd誘導凋亡的機制，考慮有以下幾個方面:①藥物對腫瘤細胞的毒性作用，促進了細胞凋亡;②體外實驗證實，Ppd使SGC-7901細胞產生明顯的G1期阻滯現象，可能給抑癌基因提供了作用的靶點，如P53蛋白即是通過將細胞周期阻滯于G1期，對損傷DNA進行修復，當修復失敗時誘導細胞凋亡;③其次Ppd抑制了腫瘤間質的血管生成，從而抑制了腫瘤組織的生長，此時腫瘤細胞凋亡的速度大于增殖的速度。

1 李羅絲，羅志勇，文 斌，等.人參皂苷Rh2對白血病HL-260細胞凋亡的誘導作用〔J〕.中國現代醫學雜志，2006;16(21):3215-7.

2 陳明俠，徐華麗，于小風，等.20(S)-原人參二醇的抗腫瘤作用及免疫調節作用研究〔J〕.中國藥師，2007;10(12):1165-8.

R28

A

1005-9202(2011)12-2250-02

吉林省科技廳資助項目(No.200705158)

秦俊杰(1965-)，男，醫學碩士，副教授，主要從事消化系統疾病的診斷和治療研究。

冷吉燕(1965-)，女，博士，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事老年疾病的研究。

〔2011-02-12收稿 2011-04-21修回〕

(編輯 袁左鳴/徐 杰)