中藥解毒通絡保腎散對實驗性糖尿病大鼠腎臟基質金屬蛋白酶2 mRNA表達的影響

何 澤 南 征 李 才 陳 曦 高 蕾 孫勝君

(長春中醫藥大學附屬醫院糖尿病科，吉林 長春 130021)

中藥解毒通絡保腎散對實驗性糖尿病大鼠腎臟基質金屬蛋白酶2 mRNA表達的影響

何 澤 南 征1李 才2陳 曦 高 蕾3孫勝君

(長春中醫藥大學附屬醫院糖尿病科，吉林 長春 130021)

目的 探討中藥解毒通絡保腎散(JDTLBSS)對實驗性糖尿病(DM)大鼠腎臟組織基質金屬蛋白酶2(MMP-2)mRNA表達的影響。方法 采用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法，檢測分別灌服JDTLBSS、氨基胍(AG)藥物8 w的鏈脲佐菌素(STZ)致DM大鼠腎臟內MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA表達。結果 在DM狀態下，大鼠腎臟MMP-2 mRNA呈低表達狀態，TIMP-2 mRNA呈高表達狀態，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA降低;與DM組比，JDTLBSS組和AG組均有提高DM大鼠MMP-2 mRNA表達，抑制TIMP-2 mRNA表達，升高MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA作用，二者作用相當。結論 JDTLBSS對DM大鼠腎臟功能和結構的保護作用機制之一可能與其上調MMP-2 mRNA表達，下調TIMP-2 mRNA表達作用，提高MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，從而促進腎小球細胞外基質(ECM)的降解有關。

糖尿病腎病;解毒通絡保腎散;實驗研究;基質金屬蛋白酶2;組織型基質金屬蛋白酶抑制物

糖尿病腎病(DN)的發生發展是多因素綜合作用的結果，腎小球基底膜增厚和以腎小球系膜區為主的細胞外基質(ECM)積聚是DN的基本病理特點。ECM積聚是基質合成和降解之間失去平衡的結果。基質金屬蛋白酶(MMPs)及其組織型基質金屬蛋白酶抑制物(TIMPs)在ECM降解中起重要作用。本文前期研究表明，中藥復方解毒通絡保腎散(JDTLBSS)能夠改善實驗性DM大鼠一般狀況，調節糖脂代謝，抑制DM大鼠腎臟肥大及高濾過，減少尿蛋白的排出，保護腎小球結構和功能〔1〕;能夠抑制晚期糖基化終末產物形成，減少其介導的腎組織損傷〔2〕。本實驗從分子水平觀察該中藥復方對鏈脲佐菌素(STZ)致DM大鼠腎臟ECM降解機制的影響，以探討JDTLBSS的深層次療效作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠55只，體重170～200 g，由吉林省實驗動物中心提供。飼料為常規大鼠飼料。實驗期間大鼠自由攝食和飲水，適應性喂養1 w，取尿糖、尿蛋白陰性的健康狀況良好的動物為實驗對象。

1.2 主要試劑和藥品 JDTLBSS(長春中醫藥大學附屬醫院制劑中心);氨基胍(AG)和STZ(Sigma);逆轉錄酶(AMV)、Oliga Dt引物、RNA酶抑制劑(Rnasin)、四種 dNTP混合液(10 mmol/L)(Promega);TaqDNA聚合酶/10×Taq酶緩沖液、10×PCR緩沖液(上海生工生物工程公司);異硫氰酸胍(Promega);焦碳酸二乙酯(DEPC)、十二烷基肌氨酸鈉、溴化乙錠(Sigma);DNA 標尺，DL-2000(Takara)。

1.3 主要設備 醫用離心機(北京);PCR儀(Ferotec，杭州大和)，臺式冷凍離心機(Hesmal，德國)，電泳儀(Mini-gel，日本)，電泳槽、恒溫水域箱、紫外分光光度計，紫外檢測儀(手提式紫外燈)，凝膠圖像處理系統(Tamon GIS-1000，上海)。

1.4 實驗動物模型的復制與分組 動物禁食12 h，按體重隨機分為2組，即正常對照組(CN，n=10)，DM模型復制組45只。DM大鼠模型復制:用50 mg/kg STZ(臨用前用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液溶解，pH4.3)單次腹腔注射。另一組僅腹腔注射上述等體積緩沖液作為對照組。注射STZ 3 d后測尿糖和血糖，尿糖+++以上，血糖水平不低于16.7 mmol/L，尿量和飲水量明顯增多者，列入DM觀察對象，共36只。將其分為三組:①DM組(DM，n=12)，②JDTLBSS處理的 DM 組(DM+J，n=12)，③AG處理的DM 組(DM+A，n=12)。DM+J組每日上午灌服JDTLBSS濃縮液2 g/kg，DM+A組每日上午灌服AG 40 mg/kg，DM組灌胃等體積水。

1.5 腎臟標本及腎組織勻漿制備 所有實驗動物自由進食和飲水，大鼠單籠飼養，每3天量體重，并觀察一般狀態。8 w末實驗結束，處死動物，快速切除腎臟，濾紙吸干，去掉包膜，用精密天平即刻稱重。取正常組、DM組、DM+A組、DM+J組的大鼠腎臟組織，用生理鹽水沖洗，剪取腎組織后稱重，按1∶9濃度(W∶V=1 g∶9 m l)加入勻漿介質，用電動玻璃勻漿器在4℃條件下制備組織勻漿。3 000 r/min離心20 min，吸取上清液保存于－70℃冰箱。

1.6 PCR引物 由上海生工生物工程公司提供(美國PE公司391型DNA自動合成儀合成)。MMP-2正義鏈引物5'-TGG GCA ACA AAT ATG AGA GC-3';反義鏈引物5'-CGG CATCCA GGT TATCGGGG-3';MMP-2擴增產物全長791 bp。TIMP-2正義鏈引物5'-GTG GAC TCTGAG AACGAC AT-3';反義鏈引物5'-CCA GGA AGG GATGTC AGA GC-3';TIMP-2擴增產物全長583 bp。β-actin正義鏈引物5'-GCC CAG AGC AAG AGA GGC AT-3';反義鏈引物 5'-GGC CAT CTC TTG CTC GAA GT-3';β-actin擴增產物全長513 bp。

1.7 腎臟組織 MMP-2 mRNA、TIMP-2 mRNA表達含量及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值檢測 采用RT-PCR方法測定。結果分析利用天能凝膠成像處理系統內部軟件對每一樣品PCR產物擴增的特異性片段(MMP-2、TIMP-2和β-actin)進行密度掃描，以β-actin密度作為參考定量標準，分別計算MMP-2、TIMP-2和β-actin密度比值作為定量結果。

1.8 統計學分析 應用SPSS13.0統計軟件進行分析，數據以±s表示，均數差異顯著性用方差分析檢驗。

2 結果

與CN組相比，DM組MMP-2 mRNA呈低表達狀態(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈高表達狀態(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA變小;DM+A組、DM+J組MMP-2 mRNA呈高表達狀態(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈低表達狀態(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值變大(P＜0.01)。與DM組比較，DM+A組、DM+J組MMP-2 mRNA呈高表達狀態(P＜0.01)，TIMP-2 mRNA呈低表達狀態(P＜0.01)，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值變大(P＜0.01)。與DM+A組比較，DM+J組MMP-2 mRNA及TIMP-2 mRNA均無顯著差異(P＞0.05)。見表1、圖1、圖2。

表1 大鼠腎臟MMP-2 m RNA、TIMP-2 m RNA相對值及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值比較(±s)

表1 大鼠腎臟MMP-2 m RNA、TIMP-2 m RNA相對值及MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值比較(±s)

與CN組比較:1)P＜0.01;與DM組比較:2)P＜0.01

組別 n MMP-2 mRNA TIMP-2 mRNA MMP-2 mRNA/10 0.70±0.05 0.69±0.03 1.03±0.05 DM組 9 0.49±0.071) 0.78±0.061) 0.77±0.081)DM+A組10 0.81±0.051)2) 0.51±0.071)2) 1.60±0.091)2)DM+J組 10 0.82±0.031)2) 0.48±0.021)2) 1.69±0.041)2)TIMP-2 mRNA CN組

圖1 各組大鼠MMP-2 m RNA/β-actin表達半定量分析

圖2 各組大鼠TIMP-2 m RNA/β-actin表達半定量分析

3 討論

合成增加和降解減慢二者共同作用使ECM積聚，從而導致腎小球結構和功能變化，最終導致腎小球硬化。MMPs系統是一類依賴金屬離子鋅并以ECM成分為水解底物的蛋白水解酶，是ECM的主要降解酶系統，MMPs活性受其抑制物TIMPs的調節，兩者的活性及它們之間的協調作用也是決定ECM降解的重要環節〔3〕。在腎小球和系膜細胞，MMP-2占優勢，其主要抑制物為TIMP-2〔4〕。MMP-2主要水解底物是變性膠原及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原和Ⅴ型膠原等，但對間質膠原無作用。MMP-2可以分解纖維黏連蛋白和層黏連蛋白。可見MMP-2為腎小球ECM主要降解酶，與DN腎臟病變的關系密切。如何選擇有效的藥物改善和糾正腎小球ECM積聚是當前DN防治中急需解決的問題。

有關中醫藥對MMPs的調節作用較少報道。研究結果表明，與正常對照組大鼠比較，STZ誘發的DM大鼠腎皮質MMP-2 mRNA表達減少，TIMP-2 mRNA表達上調，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值明顯下降，提示在DM情況下，腎小球ECM降解程度降低〔5〕。本實驗結果顯示在DM狀態下，大鼠腎臟MMP-2 mRNA呈低表達狀態，而TIMP-2 mRNA呈高表達狀態，MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA降低;JDTLBSS對DM大鼠腎臟功能和結構的保護作用機制之一可能與其上調MMP-2 mRNA表達，下調 TIMP-2 mRNA表達，提高 MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，促進腎小球ECM的降解有關。

JDTLBSS作為臨床治療DN有效處方，不僅能保護腎功能，抑制蛋白非酶糖化，而且對ECM降解酶MMP-2有一定的調節作用，這為臨床上應用中藥復方防治腎小球硬化提供了新的實驗基礎，也一定程度上為尋找中藥防治腎小球硬化提供了新的研究思路。JDTLBSS對DM大鼠腎臟功能和結構的保護作用機制之一可能與其上調 MMP-2 mRNA表達，下調 TIMP-2 mRNA表達作用，提高MMP-2 mRNA/TIMP-2 mRNA比值，從而促進腎小球ECM的降解有關，由于條件限制，本研究樣本數少，時間短，有待進一步深入研究。

1 何 澤，南 征.解毒通絡保腎散對實驗性糖尿病大鼠腎臟功能和結構的影響〔J〕.中國實用醫藥，2009;4(20):159-60.

2 何 澤，南 征，李 才.解毒通絡保腎散對晚期糖基化終末產物腎毒性影響的實驗研究〔J〕.長春中醫藥大學學報，2009;25(4):480-2.

3 Rankin CA，Suzuki K，Itoh Y，et al.Matrixmetalloproteinases and TIMPs in cultured C57BL/6J-cpk kidney tubules〔J〕.Kidney Int，1996;50(3):835-44.

4 Strongin AY，Collier I，Bannikov G，etal.Mechanism of cell surface activation of 72-KDa type Ⅳ collagenase，isolation of the activated from of the membranemetalloproteinase〔J〕.JBiol Chem，1995;270(10):5331-8.

5 于曉艷，李 才，何 澤，等.糖基化終末產物對大鼠腎皮質基質金屬蛋白酶2活性和表達的影響〔J〕.中華內分泌代謝雜志，2003;19(5):402-5.

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1005-9202(2011)12-2231-03

1 長春中醫藥大學附屬醫院中醫研究所

2 吉林大學再生醫學研究所 3 長春中醫藥大學附屬醫院肝脾胃病科第一作者:何 澤(1969-)，男，博士，副主任醫師，副教授，碩士生導師，主要從事中醫治療糖尿病及其并發癥的研究。

〔2010-10-12收稿 2011-02-12修回〕

(編輯 袁左鳴/曹夢園)