水黃皮根總黃酮提取工藝的研究

趙映淑， 朱 毅*， 董 志， 陳國彪

(1.海南省藥品檢驗所，海南省藥物質量研究重點實驗室，海南海口570216;2.重慶醫科大學，重慶400016)

水黃皮Pongamia pinnata(L.)Merr.為豆科(Leguminosae)水黃皮屬(Pongamia Vent.)的半紅樹植物，別名水流豆［1］。水黃皮在民間具有廣泛的應用，用于治療疥癬、皰疹、支氣管炎、百日咳、風濕性關節炎、消渴病、白斑病、麻風病和腰痛等疾病［2］。近年來，研究結果證明水黃皮具有巨大的藥用潛力，在抗炎鎮痛、抗菌、抗消化性潰瘍、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降糖以及鎮靜等方面具有明顯的作用，且主要活性成分為黃酮類化合物，其中呋喃黃酮為指標性成分［3-14］。本實驗采用單因素試驗和正交設計試驗法篩選醇提取水黃皮根中總黃酮的最佳工藝條件，為深入研究水黃皮的藥理作用和質量控制提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 BS210S型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司);HH-6數顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司);R-502旋轉蒸發器(上海申勝生物技術有限公司);UV-2010型紫外分光光度計(SHIMADZU)

1.2 試藥 水黃皮素(和光純藥株式會社，批號:WKR239，純度:95%);乙醇、石油醚、乙酸乙酯均為分析純;水黃皮根于2008年6月采集于海南省海口市，由海南省藥品檢驗所中藥室鑒定。

2 方法與結果

2.1 總黃酮測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取經五氧化二磷真空干燥24 h的水黃皮素對照品5.42 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得每1 mL含水黃皮素51.49 μg的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 將正交設計試驗下水黃皮根總黃酮提取液回收適量乙醇后定容至100 mL，再精密吸取1～2 mL用甲醇定容至50mL，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 測定波長的選擇 取水黃皮對照品溶液，以甲醇為空白，于200 nm～400 nm波長范圍內記錄吸收光譜，由光譜圖表明，水黃皮素在波長260 nm和304 nm處有最大吸收。另取供試品溶液，在相同條件下經紫外掃描，發現在260 nm處有最大吸收峰，故確定檢測波長為260 nm。

2.1.4 標準曲線的制備 精密吸取對照品溶液1、2、3、4、5、6、7 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。以甲醇為空白，于260 nm波長處測定各吸收度，以吸收度為縱坐標，水黃皮素濃度為橫坐標作圖回歸，得回歸方程為:Y=94.415 81X+0.008 17，r=0.999 6。結果表明，濃度在5.149～36.040 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2 提取工藝篩選

2.2.1 單因素試驗 根據預實驗結果，我們考察了乙醇濃度(40%、50%、60%、70%、80%和 90%，n=3)、提取溫度(50、60、70、80、90 ℃，n=3)、提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0 h和2.5 h，n=3)、提取次數(1 次、2 次、3 次，n=3)以及固液比(10倍、15倍、20倍和25倍，n=3)對水黃皮根總黃酮提取效果的影響。每次固定準確稱取5 g水黃皮根樣品進行試驗，所得提取液濾過后定容，測定吸光度，根據回歸方程計算提取液中總黃酮濃度，再計算提取液中總黃酮的量(總黃酮量=提取溶液中的總黃酮質量/提取時藥材質量×100%)。結果見圖1。

圖1 單因素試驗結果

單因素試驗結果表明:乙醇濃度、固液比以及提取次數對提取效果的影響較大;提取溫度在80℃～90℃時相差不大，同時提取次數越多提取越完全。綜合考慮各因素，本試驗固定提取溫度為80℃，提取次數為3次。選擇乙醇濃度、提取時間和固液比作為正交設計試驗考察的指標。

2.2.2 正交設計試驗 根據單因素試驗結果，選取乙醇濃度(%)、提取時間(h)、和固液比(m/v)為影響因素，以總黃酮量為考察指標，采用正交試驗篩選最佳提取工藝。因素水平見表1，正交試驗結果見表2。

表1 因素水平表

由正交試驗結果直觀分析和方差分析(表3)可知，影響水黃皮根總黃酮提取效果的因素順序為:A＞B＞C，A、B兩因素的影響具有顯著性，C不具顯著性。得最佳工藝組合為A2B2C3，即每1 g藥材用20倍量60%乙醇提取3次，每次1.0 h。

表2 L9(34)正交設計

表3 方差分析結果

2.3 最佳提取工藝的驗證試驗 準確稱取3份干燥的水黃皮根粉5 g，按最佳工藝條件平行操作測吸光度，根據回歸方程得出水黃皮根中總黃酮量，結果見表4。

表4 最佳工藝驗證結果

驗證試驗結果表明:采用最佳工藝條件提取時，水黃皮根總黃酮提取率均高于其他正交試驗提取率，說明本試驗篩選的最佳提取工藝條件比較合理，同時具有較好的穩定性。

3 討論

3.1 水黃皮根中含有的黃酮類化合物主要是水黃皮素、水黃皮黃素等呋喃黃酮類［15］，易溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷等有機溶劑，不溶于水。為了建立適應工業化生產的提取方法，本試驗選擇乙醇溶液作為水黃皮根總黃酮的提取溶劑，采用單因素試驗和正交設計試驗篩選了最佳提取工藝條件。驗證試驗結果表明，60%乙醇溶液可作為水黃皮根總黃酮的最佳提取溶劑。

3.2 本實驗對水黃皮根總黃酮的提取方法進行了初步探討，旨在為近一步研究提供實驗基礎。

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