一種改進的非人靈長類神經(jīng)功能缺損評價方法

朱 華，盧 珊，馮 銘，李 秦，劉 穎，代小偉，安沂華，趙春華，王任直，秦 川

(1.中國醫(yī)學科學院，北京協(xié)和醫(yī)學院，醫(yī)學實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學重點實驗室，

國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021；2.中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所motac合作實驗室，北京 100050；

3.中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院，北京 1000730；4.中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所，北京 100005；5.北京神經(jīng)外科研究所，北京 100050)

動物模型是研究腦血管疾病損傷機制和防治措施必不可少的工具。評價量表在監(jiān)測臨床腦卒中病情變化、療效判斷、預測結(jié)局及大樣本臨床試驗研究中起重要作用。目前為止國際上尚無一個公認的可用于多中心臨床研究的腦卒中評定量表，與之相關(guān)的靈長類腦卒中動物模型及神經(jīng)行為評價方法更是缺乏，嚴重影響了臨床科研資料的可比性。針對這個問題，在進行食蟹猴腦出血模型制作及干細胞治療的研究過程中，我們對目前靈長類腦卒中模型評價中常用的KITO［1］量表進行修改和細化后對實驗猴的神經(jīng)功能進行了動態(tài)量化觀察，使其更適于靈長類腦卒中神經(jīng)功能缺損的評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年雄性食蟹猴12只，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，年齡4～6歲，體重4.2～4.5kg。

1.2 腦出血模型的制作

使用自體股動脈抗凝血腦內(nèi)注射方法建立腦出血模型，見參考文獻［2］

1.3 干細胞治療

1.3.1 動物分組：12只動物分為模型對照組、高劑量組、低劑量組，分組的原則是各組動物間體重沒有顯著性差異。各組劑量見下表。

1.3.2 細胞注射：細胞為250μL的無色懸液，2個移植途徑，每個移植路徑分3個點注射，每點移植量為40μL，細胞數(shù)約6.7×105，移植速度10μL/min。對照組：等體積生理鹽水。

1.4 神經(jīng)功能評分

原始評價量表來源于文獻1，在原表格基礎(chǔ)上進行細化修改。其中意識28分，感覺系統(tǒng)22分，運動系統(tǒng)32分，骨骼肌共濟協(xié)調(diào)18分共100分。造模后6h，1d，3d，1w及干細胞注射后1d，3d，1w，2w，3w，4w在每天的固定時間使用文獻中的表格和改進的表格同時進行評分。表中的“威逼”刺激特指使用鈍頭鋼條輕輕接觸或試圖接觸動物。沒有任何捅、刺、扎、撥、挑等的強制外力施加于動物。聲音刺激特指使用鈍頭鋼條輕輕敲擊動物籠具發(fā)出的70db左右的金屬碰撞聲。接觸刺激特指使用毛刷輕輕接觸動物肌膚。除輕微的掃刷力量外，沒有其他任何強制外力施加于動物。所有評分由同一名有經(jīng)驗的評價者完成。

表1 人骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療食蟹猴腦出血實驗分組Tab.1 The grouping of the animal

表2 改進的神經(jīng)功能評價表Tab.2 The proved neurological deficit scale

續(xù)表

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS13.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計方法采用相關(guān)性分析，單因素方差分析，P＜0.05時認為有顯著性差異。

2 結(jié)果

造模手術(shù)前，所有動物的行為表現(xiàn)均正常，神經(jīng)功能評分為0。造模手術(shù)后6h，動物在麻醉蘇醒后均出現(xiàn)了與血腫部位相對應的神經(jīng)系統(tǒng)定位體征。主要表現(xiàn)為有意識但情緒低落，對刺激不反抗。受到威逼刺激能夠行走，但攀爬困難。對腳趾疼痛有弱的、不完全的、不協(xié)調(diào)的收縮反應。左前肢出現(xiàn)明顯的麻痹，失去運動能力。用修改前后的表格評分均為31分左右。但從術(shù)后24h開始出現(xiàn)評分上的差異。隨著時間的推移這種差異更加明顯。干細胞注射前將動物進行隨機分組后，用原表格評價的分數(shù)各組之間雖然沒有統(tǒng)計學上的顯著性差異，但低劑量組的分數(shù)比高劑量組和模型組低且標準差較大。改進表格統(tǒng)計的數(shù)據(jù)較平均，因此在注射干細胞后采用改進的表格進行評分。結(jié)果顯示干細胞注射后1周開始到動物被安樂時，劑量組與對照組之間的神經(jīng)功能評分出現(xiàn)顯著性差異(p＜0.05)。高、低劑量組間未見顯著性差異。

3 討論

腦卒中臨床神經(jīng)功能缺損程度評分標準在治療預后評估方面有很好的參考價值。臨床醫(yī)師根據(jù)長期臨床經(jīng)驗，提出好的腦卒中評定量表應滿足以下標準［3］：1、量表應包括足夠的神經(jīng)功能缺損評定項目，而且包含的項目對結(jié)局有預測性；2、量表的重測信度和評定者間信度好，內(nèi)部一致性好；3、量表應敏感，評分要覆蓋神經(jīng)功能缺損的整個范圍；4、使用方便，使用者易掌握，整個評定時間最好不超過14min。為了評分的可信性應該只包括定義明確、容易評分的項目；但為保持量表整體的敏感性，量表中應包括能體現(xiàn)各種腦卒中類型的項目。這兩者之間就存在著矛盾。所以在制訂腦卒中評定量表時應全面考慮綜合分析。雖然靈長類動物大腦的構(gòu)筑、白質(zhì)與灰質(zhì)的比值及微血管網(wǎng)絡(luò)的分布區(qū)域與人類似，但種系發(fā)生上的差異使評價靈長類動物的神經(jīng)功能缺損不能簡單的平移臨床量表［4，5］。可準確反映靈長類神經(jīng)功能缺損的量表必須根據(jù)靈長類動物的特點結(jié)合臨床指標而設(shè)計［6］。我們之所以已Kito的表格為基礎(chǔ)進行改進主要原因有以下幾點：1、評分表的格式采用的是臨床常用的glasgow昏迷評分，比較直觀。2、內(nèi)容設(shè)置比較全面合理：評分包含4各方面：意識、骨骼肌協(xié)調(diào)、感覺系統(tǒng)和運動系統(tǒng)。其中前3項既與臨床相關(guān)，是臨床評分表格中的必備項目，又體現(xiàn)了動物野外生存應對外界危機各種刺激的反應能力。在運動功能的檢查項目中，首先是將前后肢分開進行評價，因為猴的前肢功能在進化過程中基本獨立出來，主要用于抓握和攀爬等，前肢功能損傷會嚴重降低動物的野外生存能力。另外在每個分項目均有反映肢體麻痹的內(nèi)容，并把左右前肢分開評價。我們的實驗也證實造模手術(shù)主要影響動物對側(cè)上肢的感覺運動功能，同側(cè)則幾乎不受影響。因而把左右前肢分開評價非常必要。

表3 造模及干細胞治療前后神經(jīng)功能評分結(jié)果Tab.3 Neurological deficit score after stroke and human mesenchymal stem cell transplantation

感覺和反射功能在神經(jīng)功能評價中占有很重要的地位，但往往因為無法準確檢查而不被包括在檢查項目中。原表格中雖然對深淺感覺和各項反射功能進行了列項，但評價標準比較模糊，而且每個條目之間分差較大，當動物癥狀不明顯時量表的敏感性減低。即損傷程度越輕，改進表格與原表評分結(jié)果之間的差異越顯著。我們的評分結(jié)果也證實了這一點：術(shù)后3d即癥狀最嚴重的時期，兩個評分表間的差異不顯著。從術(shù)后7 d開始兩種評分方法出現(xiàn)了統(tǒng)計學上的差異。

改進的表格對原表格所列條目進行了逐級細化；對給與動物的刺激進行分類并對每種刺激明確定義，使評價者易于掌握和準確打分。這樣即使是神經(jīng)功能的細微恢復(如由表現(xiàn)為手指抓握時持續(xù)翹趾的中度痙攣和無力到偶爾翹趾的輕度痙攣和無力)也能表現(xiàn)出來。而正是這些細微功能對于動物的整體神經(jīng)功能恢復評價具有重要作用。

靈長類腦卒中模型能較好的模擬人類腦血管疾病，但因涉及動物倫理、實驗成本等原因使用較少，更缺乏標準的模型制作方法和神經(jīng)功能評價方法。改進的量表在原表格包括運動、感覺和反射功能等信息的基礎(chǔ)上，對原有條目進行細化和規(guī)范，克服了舊表格中分差大，評價標準模糊的缺點，即使動物的行為學癥狀不明顯時也能評價出差異，使量表的敏感性大為提高。改進的量表可信度增高、可實施性增強，具有良好的臨床相似性和可操作性。為建立標準化神經(jīng)功能功能評價量表進行了有益嘗試。

［1］Kito G，Nishimura A， Susumu T， et a1. Experimental thromboembolic stroke in cynomolgus monkey［J］.J Neurosci Methods，2001，105(1)：45-53.

［2］朱華，李秦，馮銘，等.食蟹猴腦出血模型的建立及評價［J］.中國比較醫(yī)學雜志.2009，19(7)，29-32.

［3］Hantson L，DeWeerdt W，DeKeyser J，et al.The European stroke Scale［J］.Stroke，1994，25：2215-2219.

［4］Ben R，Naimath K，Eray T，et a1.Chronic ischemic stroke model in cynomolgus monkeys：behavioral，neuroimaging and anatomical study［J］.Neurol Res，2003，25(1)：68-78.

［5］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of cognitive and motor deficits in a marmoset model of stroke［J］.ILAR J，2003，44(2)：153-160.

［6］Marshall JW，Ridley RM.Assessment of functional impairment following permanent middle cerebral artery occlusion in a nonhuman primate species［J］.Neurodegeneration，1996，5(3)：275-286.