塞來昔布對高脂血癥大鼠腦缺血再灌注后MMP-9和COX-2表達的影響▲

張小菊 王 荔 高建英

山西醫科大學第二附屬醫院神經內科 太原 030001

塞來昔布對高脂血癥大鼠腦缺血再灌注后MMP-9和COX-2表達的影響▲

張小菊 王 荔△高建英

山西醫科大學第二附屬醫院神經內科 太原 030001

目的觀察塞來昔布對高脂血癥(hyperlipidem ia,H L)大鼠腦缺血再灌注損傷后基質金屬蛋白酶-9(metalloproteinase-9,MMP-9)、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表達的影響。方法健康雄性Wister大鼠 70只隨機分為 4組：正常假手術組(S組)10只、正常缺血再灌注組(nIR組)20只、高脂缺血再灌注組(h IR組)20只和高脂缺血再灌注塞來昔布干預組(C+hIR組)20只。后3組又分為缺血1 h再灌注12 h、24 h、48 h 3個時間點。采用高脂飲食建立高脂血癥大鼠模型,應用線栓法制做大鼠大腦中動脈栓塞模型。用免疫組化法檢測腦組織MMP-9、COX-2的表達,氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測定梗死灶體積。結果在同一缺血再灌注時間點,與n IR組比較,hIR組、C+h IR組腦組織MMP-9、COX-2表達明顯增高(P＜0.01),h IR組梗死體積增大具有統計學意義(P＜0.01),C+hIR組梗死體積增大具有統計學意義(P＜0.05);與hIR組相比,C+h IR組腦組織MMP-9、COX-2表達下降、梗死體積減小(P＜0.01),腦缺血再灌注后腦組織中MMP-9、COX-2的表達有顯著的相關性(r=0.835)。結論高脂血癥合并腦缺血再灌注損傷病理過程中炎癥反應起重要作用。塞來昔布對高脂腦缺血再灌注大鼠COX-2、MM P-9的過度表達產生抑制作用,干預炎癥反應減輕腦缺血再灌注損傷。

高脂血癥;腦缺血再灌注損傷;基質金屬蛋白酶-9;環氧化物酶-2;塞來昔布

在腦缺血的病理生理過程中,腦缺血后的炎癥反應日益受以重視,最初腦損害是由于血供障礙缺氧造成的,隨后由于缺血缺氧所繼發的系列級聯反應所引發。炎癥在這眾多級聯損害中起重要作用,尤其再灌注后炎癥反應進一步加劇腦缺血損傷,阻斷再灌注后炎癥級聯反應是改善缺血后繼發性腦損傷的理想策略。

臨床上有相當比例的腦梗死患者合并有高血脂癥,高膽固醇血癥已是腦卒中的危險因素,本實驗采用高脂飲食制作高脂血癥大鼠模型,從腦缺血再灌注損傷發生后的細胞炎性損傷入手,利用塞來昔布干預高脂血癥大鼠腦缺血再灌注模型,探索其作用機制,擬為尋求臨床上的腦保護治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 動物與實驗分組 健康雄性Wistar大鼠70只,體質量(110±10)g,4～5周齡(山西醫科大學生理教研室提供)。實驗分組：先隨機分為2組：普通飼料喂養組30只及高脂飼料喂養組40只。以上大鼠同期喂養8周后,普通飼料喂養組隨機分為2組：假手術組(S組)10只和正常缺血再灌注組(n IR組)20只;高脂飼料喂養組隨機分為2組：高脂缺血再灌注組(h IR組)20只和高脂缺血再灌注缺血塞來昔布干預組(C+h IR組)20只。后3組并隨機分為3個亞組：分別于缺血1 h再灌注后 12 h、24 h、48 h處死,各亞組分別有 5、10、5只大鼠。假手術組僅取24 h時間點作為對照。高脂缺血再灌注塞來昔布干預組缺血1 h后給予生理鹽水新鮮配置的塞來昔布懸液25 mg/kg灌胃(其他各組在缺血后1 h后給予等量生理鹽水灌胃)。各亞組及假手術組取5只行免疫組化染色,僅取24 h時間點5只大鼠行 TTC染色。

1.2 動物模型制備 首先建立高脂血癥模型：給予高脂飼料喂養。連續喂養大鼠8周,斷尾取血2m L,用于檢測血脂四項。血脂測定與同期普通飼料喂養大鼠的血脂差異具有統計學意義(P＜0.05)。腦缺血再灌注模型制備：采用改良的Longa線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞(m idd le cerebral artery occlusion,MCAO)模型,假手術組操作過程同上,但栓線插入深度＜10 mm。取神經功能缺損評分為1～3分的大鼠作為研究對象。

1.3 腦梗死體積比測定 各實驗組各取5只成膜大鼠再灌注24 h斷頭取腦。將鼠腦置于-20℃冰箱20 m in使之發硬,再將其切成5等份冠狀位切片,置于2%TTC溶液中,37℃水溶,10%甲醛液固定。通過圖象分析系統進行切片梗死體積及全腦梗死體積計算,各樣本以梗死體積/全腦體積比作統計數據。

1.4 免疫組化測定 灌注后開顱取腦制成蠟塊,連續切片,光鏡下觀察胞漿或胞核有棕色顆粒者為陽性細胞。每只大鼠取4張連續切片,在400倍光鏡下每張組織切片在缺血側隨機選4個不重復視野,采用圖像分析系統測定每只動物MMP-9、COX-2陽性細胞的平均光密度值取平均值作為統計參數。

1.5 統計學分析 實驗數據計量資料用均數±標準差表示,用SPSS13.0統計軟件包進行t檢驗和單因素方差分析。相關性分析采用Pearson相關分析。P＜0.05為有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 塞來昔布對局灶性腦缺血大鼠梗死灶體積的影響 假手術組大鼠腦組織無梗死灶,呈均勻一致的紅色。余各組大鼠腦組織均顯示不同范圍的蒼白色梗死灶,n IR組、h IR組梗死體積比分別為(20.68±1.09)和(32.13±1.22)%,與 nIR組相比,h IR組腦梗死灶體積增大(P＜0.01);C+h IR組梗死體積比為(24.03±1.35)%,與h IR組相比梗死體積減小(P＜0.01),與 nIR組相比梗死體積增大(P＜0.05)。

2.2 再灌注后不同時間點各組大鼠腦組織中M MP-9的表達 見表1、圖1A～圖1C。免疫組化顯示,S組腦組織中可見少量淡染的棕黃色MMP-9陽性細胞,散在分布于大腦皮質、海馬區域。再灌注12 h,缺血側腦組織MM P-9陽性細胞表達增多,顏色增強。再灌注24 h MMP-9陽性細胞表達達高峰,48 h表達下降,但在不同時相MMP-9陽性細胞的形態大小不一致,可在缺血梗死區,梗死灶周圍出現,在神經元、星形膠質細胞、內皮細胞、中性粒細胞中見到。同一時間點,與n IR組比較,h IR組、C+h IR組增高(P＜0.01);C+hIR組較h IR組降低(P＜0.01)。

2.3 再灌注后不同時間各組大鼠腦組織中COX-2的表達

見表2、圖 1D～圖 1F。COX-2陽性細胞呈棕黃色。S組COX-2陽性神經元散在于大腦皮質,海馬區,數量極少,再灌注12 h組在缺血側額頂葉皮層可見大量棕黃色淡染陽性細胞。再灌注24 h,缺血邊緣區相當于缺血半暗帶區可見大量COX-2陽性表達,顏色增強,COX-2陽性細胞表達達高峰。48h表達下降,與n IR組比較,h IR組、C+h IR組表達明顯增高(P＜0.01),C+h IR組較hIR組明顯降低(P＜0.01)。

表1 缺血再灌注不同時間點各組MMP-9陽性細胞的平均吸光度值 (±s)

表1 缺血再灌注不同時間點各組MMP-9陽性細胞的平均吸光度值 (±s)

與nIR組比較,▲P＜0.01;表示與 h IR組比較,★P＜0.01;S組與其余各組比較,■P＜0.01;-表示未做檢測

組別 n 再灌注12 h組再灌注24 h組再灌注48 h組S 組 5 - 0.188±0.021■ -nIR 組 5 0.304±0.019 0.341±0.022 0.282±0.024 hIR 組 5 0.357±0.031▲ 0.424±0.02▲ 0.339±0.014▲C+h IR 組 5 0.323±0.152▲★ 0.365±0.021▲★ 0.302±0.013▲★

表2 缺血再灌注不同時間點各組COX-2陽性細胞的平均吸光度值(±s)

表2 缺血再灌注不同時間點各組COX-2陽性細胞的平均吸光度值(±s)

與n IR組比較,▲P＜0.01;與 h IR組比較,★P＜0.01;S組與其余各組比較,■P＜0.01;-表示未做檢測

組別 n 12 h組 24 h組 48 h組S 組 5 - 0.174±0.023■ -nIR 組 5 0.233±0.013 0.299±0.025 0.223±0.011 hIR 組 5 0.289±0.010▲ 0.365±0.034▲ 0.269±0.02▲C+h IR 組 5 0.254±0.017▲★ 0.323±0.021▲★ 0.248±0.014▲★

2.4 腦缺血再灌注后腦組織 MMP-9與COX-2表達相關性分析,兩者表達具有顯著正相關性,差異有統計學意義(r=0.835,P＜0.01)。

3 討論

MMP-9是基質金屬蛋白酶系(MMPs)中的一員,是一種依賴鋅離子的金屬蛋白酶,主要功能是降解和重塑ECM。缺血腦組織受到炎癥刺激使星形膠質細胞、小膠質細胞、巨噬細胞等多種細胞分泌MMP-9。腦缺血后MMP-9可降解基底膜的主要成分,如Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白,導致血管完整性破壞,血腦屏障破壞,腦水腫形成以及在繼發性腦損傷過程中發揮關鍵性作用[1]。

COX-2是花生四烯酸代謝過程中最重要的限速酶。在大多數正常組織內檢測不到,可以被生長因子、細胞因子或其他的炎癥介質所誘導。腦組織在正常情況下可少量表達COX-2,Yokota等[2]對大鼠腦缺血再灌注模型的研究顯示,缺血后30m in,COX-2m RNA在半暗帶和未受損的扣帶回表達增強,24 h時與缺血中心區比較,仍維持較高水平。多年的研究證實,環氧化酶激活是腦缺血性腦損傷過程中觸發和促進炎癥反應的關鍵因素之一,COX-2是炎癥所致細胞毒性的關鍵因子。

該研究結果顯示,腦缺血再灌注后,缺血腦組織中炎性因子MMP-9和COX-2表達水平明顯增高,在缺血再灌注24 h表達高峰,與以往研究結果相一致[3-4],且可以證實腦缺血再灌注大鼠腦組織存在明顯的炎性反應。hIR組與n IR組比較,兩者表達水平明顯升高,梗死體積增大。表明高脂血癥大鼠發生腦缺血再灌注后,炎癥反應加重,從而加重腦缺血再灌注后損傷。研究表明,動脈粥樣斑塊中COX-2能夠促進炎癥細胞合成與釋放MMPs,COX-2及前列腺素產物能活化MMPs[5]。孫春雷[6]等研究發現乳腺癌組織中COX-2和MMP-9蛋白高表達,且兩者具有顯著正相關性,過度表達的COX-2,促進了PGE2合成,從而刺激MM P-9分泌或者可能直接誘導MMP-9表達上調。該研究發現缺血再灌注組腦組織COX-2與MM P-9表達在時間上是一致的,兩者表達呈顯著正相關性。從而推測腦缺血再灌注后COX-2表達增加及其產物促使MMP-9表達增加。

減少或抑制COX-2和MMP-9過度產生可能是防治腦缺血再灌注損傷的有效途徑,近年的研究發現,在大鼠腦缺血再灌注中,尼美舒利還能夠抑制炎性因子MMP-9、MMP-2的表達[7],減少梗死形成,改善神經功能,減輕血腦屏障損壞及水腫,減少白細胞浸潤以及具有持久的神經保護作用[8]。在ACS患者中采用選擇性COX-2抑制劑塞來昔布干預單核細胞,發現塞來昔布能抑制單核細胞分泌IL-6和MMP-9[9]。該實驗結果表明,C+hIR組COX-2和MM P-9表達較hIR組明顯下降,梗死體積減小。從而推測塞來昔布作為選擇性COX-2抑制劑,可通過抑制高脂腦缺血再灌注損傷中COX-2的表達,進一步抑制MMP-9表達,減輕炎癥反應,減小梗死體積,減輕腦缺血再灌注損傷。盡管高脂腦缺血再灌注模型給予塞來昔布干預,但與n IR組相比梗死體積較大,MMP-9、COX-2表達增高差異有統計學意義。表明在高脂血癥的基礎上發生腦缺血再灌注后,MM P-9、COX-2介導的炎癥反應可能在高脂腦缺血再灌注中起重要的作用,其機制有待于進一步研究。

總之,塞來昔布與其他傳統非甾體類抗炎藥相比,塞來昔布具有特異性抑制COX-2表達的特點,而不影響COX-1活性及其正常的生理功能,塞來昔布的不良反應最小,在塞來昔布使用普通劑量的研究中并未出現心血管事件發生增加[10],并有研究顯示塞來昔布能保護血管內皮功能[11],故在臨床有著引人注目的應用前景。是否可用于腦梗死的治療仍需大量的動物及臨床實踐證明。

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山西省高校核科技研究開發項目,編號：20091181△

王荔,山西醫科大學第二醫院神經內科

Email：w angll1997@163.com

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1673-5110(2011)07-0026-04

(收稿2011-01-21)