滅幽湯對幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織IKKβ表達的影響

施花錦 ，王小娟 ，伍參榮 ，郭建生 ，夏 歷 ，劉 羽

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

滅幽湯對幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠胃組織IKKβ表達的影響

施花錦1，王小娟2*，伍參榮1，郭建生1，夏 歷2，劉 羽1

（1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

目的 探討IκB分子的上游蛋白激酶（IKKβ）在幽門螺桿菌相關性胃炎（HAG）病理變化的可能作用機制及滅幽湯的影響效應。方法 建立HAG模型，將造模成功的小鼠按體質量隨機分為模型組、麗珠得樂組，滅幽湯組。采用免疫組化法檢測胃黏膜組織中核轉錄因子(NF-κB)、IKKβ的蛋白表達情況。HE染色觀察胃組織病理變化。結果 滅幽湯組能明顯減輕胃組織的炎癥反應，滅幽湯組胃黏膜炎癥程度低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；能抑制HAG胃組織中NF-κB、IKKβ蛋白的活性，滅幽湯組NF-κB、IKKβ表達強度明顯低于模型對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 NF-κB和IKKβ在HAG的炎癥反應中發揮重要的作用，滅幽湯治療HAG的可能作用機制是通過抑制IKKβ的激活，阻止其活化。

滅幽湯；幽門螺桿菌；胃炎；核轉錄因子；IκB分子的上游蛋白激酶；小鼠；黃芩；蒲公英；烏賊骨

幽門螺桿菌相關性胃炎（Helicobacter pyloriassociated gastritis，HAG）仍是目前消化系統的頑疾之一，H.pylori的致病機理尚不明確。因此，進一步闡明HP相關性胃病的發病機制，開拓新的治療途徑是醫學界亟待解決的重要課題。近年來對NF-κB激活的信號通道研究較多，研究發現IKKβ是NF-κB信號途徑的關鍵成員，IKK的作用是結合并將IκB磷酸化，使NF-κB能入核。滅幽湯是臨床治療幽門螺桿菌相關性胃炎的有效復方，本研究從NF-κB、IKKβ的角度出發，探討滅幽湯對HAG的治療作用及可能的作用機制。現將實驗方法及結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級雄性昆明小鼠50只，體質量（25±5）g，由湖南省長沙市開福區東創實驗動物科技服務部提供，動物合格證號：SCXK(湘)2006-0001。

1.1.2 藥物 滅幽湯（由黃芩、蒲公英、青皮、陳皮、三七、白及，烏賊骨等藥組成）由湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房提供，將中藥浸泡30 min后用武火煎煮3次，濃縮至含生藥2 g/mL，高溫滅菌后保存備用。麗珠得樂，由麗珠集團麗珠藥廠生產（批號：國藥準字，H10900086）。

1.1.3 試劑 快速尿激酶檢測試劑購自福建三強生物有限公司。免疫組化NF-κB、IKKβ和IL-8一抗、二抗及SABC,購自武漢博士德生物有限公司。

1.1.4 儀器 SHANDON-AS325切片機（上海科技大學儀器）；Y-I6生物組織攤烤片機（湖北孝感亞光醫用電子技術研究所）；Olympus雙目生物顯微鏡（日本Olympus公司產品）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及分組 取昆明小鼠50只適應性飼養1周后按體質量均勻分組：正常對照組10只，造模組30只。根據預實驗結果[1]，采用HP菌液灌胃法建立幽門螺桿菌感染動物模型，除空白對照組外其他動物實驗組小鼠第1天經禁食24 h后,用胃管灌胃50%乙醇0.2 mL/只，1 h后灌胃給以Hp菌株(109CFU/mL，0.5 mL)；實驗在第 3、5、7、9 天重復上述操作。 于全部接種結束后第5天，分為滅幽湯組10只、麗珠得樂組10只，分別給予滅幽湯和麗珠得樂，用藥14 d，模型組、正常組分別給予等量的生理鹽水。

1.2.2 給藥方法及劑量 滅幽湯組按33.79 g/kg灌服滅幽湯煎液，麗珠得樂20 mg/kg，給藥劑量均按60 kg成人體表面積計算，相當成人用量的4倍，空白組和模型組灌胃生理鹽水15 mL/kg每日1次，連續用藥2周。

1.2.3 胃黏膜病理組織學檢測 采用HE染色法觀察小鼠胃黏膜炎癥程度，炎癥程度分級參照人胃炎的分類法，均屬于慢性淺表性胃炎,根據炎細胞的數量及浸潤胃壁的深度分為3級并記分:無炎癥0分,輕度炎癥1分,中度炎癥2分,重度炎癥3分。

1.2.4 NF-κB、IKKβ的蛋白表達 采用免疫組化法檢測（操作方法參考相關試劑盒說明書）。采用病理圖像分析系統對免疫組化染色切片進行圖像分析，每張切片隨機選擇10個視野，在高倍鏡下計算其平均光密度（OD）求其平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 對各組小鼠一般情況觀察

模型組小鼠體毛缺乏光澤，精神不振，活動遲緩，其余各組小鼠情況良好，各組小鼠體質量和攝食情況無明顯變化。

2.2 對小鼠胃黏膜病理組織學的影響

光鏡下，正常組小鼠胃黏膜上皮完整，固有層內有密集排列的腺體，大鼠胃黏膜底部可見極少量散在淋巴細胞。模型組大鼠胃竇部的炎癥程度較重，固有層內可見較多的淋巴細胞、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤。各治療組動物的炎癥均較模型組有所減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。表1可見給藥組的急性炎癥及慢性炎癥評分明顯下降。

表1 對各組小鼠胃竇部黏膜病理組織學的影響（n=10，）

表1 對各組小鼠胃竇部黏膜病理組織學的影響（n=10，）

注：與模型組比較*P<0.05；與麗珠得樂組比較★P>0.05。

組 別正常組模型組滅幽湯組麗珠得樂組劑量（g/kg）— —0.034 0.128胃黏膜慢性炎癥0.19±0.39*1.56±0.36 0.26±0.34*★0.48±0.34*胃黏膜急性炎癥0 1.38±0.42 0.20±0.40*★0.32±0.42*

2.3 對各組小鼠胃黏膜組織IKKβ和NF-κB表達的影響

正常對照組小鼠胃黏膜組織細胞內均有少量IKKβ、NF-κB表達。與正常比較,模型組小鼠胃黏膜IKKβ及NF-κB表達增加,差異有統計學意義 (P<0.05)；與模型組比較,滅幽湯組小鼠胃黏膜IKKβ及NF-κB表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)；與麗珠得樂組比較，滅幽湯組小鼠胃粘膜IKKβ及NF-κB表達差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4 免疫組化NF-κB、IKKβ的蛋白表達

正常組胃黏膜組織細胞胞漿內有少量NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀陽性反應物，模型組胃粘膜組織細胞胞漿內有NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀強陽性反應物，滅幽湯組胃黏膜組織細胞胞漿NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀陽性反應物明顯減少，麗珠得樂組：胃黏膜組織細胞胞漿內有中等量NF-κB、IKKβ蛋白棕色顆粒狀陽性反應物，見圖1～2。

表2 各組小鼠胃黏膜組織IKKβ和NF-κB 蛋白表達情況 （n=10，，OD）

表2 各組小鼠胃黏膜組織IKKβ和NF-κB 蛋白表達情況 （n=10，，OD）

注：與模型組比較*P＜0.05；與麗珠得樂組比較★P＞0.05。

組 別 劑量（g/kg）NF-κBIKKβ正常組 — 0.125±0.086*0.068±0.042*模型組 —0.235±0.0880.251±0.078滅幽湯組0.1280.150±0.042*★0.126±0.120*★麗珠得樂組0.0340.137±0.076*0.104±0.074*

圖2 胃黏膜組織細胞中IKKβ的蛋白表達光鏡圖（免疫組化×200）

3 討論

NF-κB是細胞活化和產生細胞因子的重要轉錄調控因子。在靜止細胞胞液中,NF-κB與IκB(κB的抑制劑)結合,處于失活狀態。細胞活化傳遞的信號激活 IκB 激酶(IKK),IKK 催化 IκBα(Ser32、Ser36)和IκBβ(Ser19、Ser32)磷酸化,使 IκB 與 NF-κB 解離后被降解,于是NF-κB進入核內,調節多種基因轉錄[2]。當受到某些細胞因子（如腫瘤壞死因子、白介素-1、白介素-8等）、脂多糖（LPS）、細菌及病毒產物及一些氧化劑等細胞外信號刺激時，刺激信號借受體將信號傳遞至胞漿，先激活IκB激酶（IKK）的上游激酶而促使IKK活化，活化的IKK可使IκBαN端調節區的兩個絲氨酸殘基scr32/36磷酸化，繼而泛素化，再經26S蛋白酶小體降解，這時NF-κB二聚體從NF-κB/IκB α三聚體復合物釋放，發生核轉位從胞漿進入細胞核，與其靶基因中啟動子或增強子的κB基因序列結合從而啟動下游基因轉錄，發揮其生物學作用。最新的研究發現,IKK-β是I-κB磷酸化激酶,它誘導 I-κB 磷酸化,使 NF-κB/I-κB 二聚體解離,暴露NF-κB的核定位片段是NF-κB活化和移位的前提[3-6]。本研究采用免疫組化法來反映機體受到外界刺激時導致NF-κB活化的上游激酶IKK-β的激活水平。

滅幽湯方中以清熱利濕、理氣和胃立法，結合多年的臨床經驗組方而成。方以黃芩、蒲公英清熱燥濕解毒為君，以除脾胃之濕熱；青皮、陳皮行肝脾氣滯以疏通氣機；佐以三七、白及，既活血化瘀助青皮、陳皮協調氣血之運行，又收斂生肌修復局部之病灶；重用烏賊骨制酸止痛而為之使。現代研究表明：清熱解毒中藥能夠改善胃黏膜炎癥細胞浸潤，黃芩、蒲公英能抗多種病原微生物，對多種球菌和桿菌有殺滅作用；白及祛腐生肌可修復糜爛的胃黏膜；烏賊骨含有豐富碳酸鹽和磷酸鹽能改變胃的酸性內環境，抑制HP的生長；三七活血化瘀止痛、消炎生肌，能促進血液循環消除組織水腫，促進黏膜增生，加快修復，臨床研究顯示本方對HAG患者具有較好的療效。這些藥物直接或間接的抗炎作用可能是本方改善胃黏膜炎癥的基礎。

本研究結果顯示，幽門螺桿菌感染性胃炎小鼠給予滅幽湯治療后，小鼠的胃黏膜組織黏膜炎癥部位NF-κB表達、炎癥細胞密度均顯著減低。IKK-β在模型組中的表達明顯高于正常組，說明其在HAG病理生理反應和組織器官損害中發揮重要作用,經滅幽湯干預后的IKK-β表達減少，滅幽湯可能通過抑制IKK-β的激活,阻斷NF-κB的活化，從而緩解了HAG的進一步發生和發展，起到治療的作用。

[1]張榮光，段廣才.幽門螺桿菌感染的昆明小鼠模型的建立[J].中華醫學雜志，2006，86（12）：857-859.

[2]May M J.Science[M].1999,284:271-272.

[3]Kwok B H,Koh B,Ndubuisi M I,et al.The anti-inflammatory natural product parthenolide from the medicinal herb Feverfew directly binds to and inhibits IκB kinase[J].Chem Biol,2001,8(8):759-766.

[4]Sizemore Nywana,Lerner Natalia,Dombrowski Nicole,et al.Distinct roles of the IκB kinaseαandβsubunits in liberating nuclear factor κB(NF-κB)from IκB and in phosphorylating the p65 subunit of NF-κB[J].J Biol Chem,2002,277(6):3 863-3 869.

[5]Senftleben Uwe,Karin Michael.The IKK/NF-κB pathway[J].Crit Care Med,2002,30(1Suppl):S18-26.

[6]Huber Margit A,Denk Andrea,Peter RalfU,et al.The IKK-2/κBα/NF-κB pathway plays a key role in the regulation of CCR3 and eotaxin-1 in fibroblasts.A critical link to dermatitis in IκBαdeficient mice[J].J Biol Chem,2002,277(2):1 268-1 275.

（本文編輯 彭芝配）

Effect of Mieyou decoction on expression of IKKβ in gastric tissue of Helicobacter pylori-associated gastritis in mice

SHI Hua-jin,WANG Xiao-juan,WU Can-rong,GUO Jian-sheng,XIA Li,LIU Yu
(TCM University of Hunan,Changsha,Hunan 410007,China)

Objective To discuss the effects of Mieyou decoction on IKKβ in Helicobacter pylori-associated gastritis(HAG)and its possible mechanisms on pathological changes.Methods After HAG models were established,the mice were randomly divided into model,Cabernet Franc Sidel and Mieyou decoction groups according to the weight.The expression of NF-κB and IKKβ protein in gastric mucosa tissue were detected with immunohistochemical and gastric tissue pathological changes with HE staining. Results The mucosal inflammation in Mieyou decoction group was significantly lighter than that in model control group(P<0.05);inhibit the activities of NF-κB and IKKβ,the expression intensity of NF-κB and IKKβ was lower than that in model group(P<0.05).Conclusion NF-κB and IKKβ play an important role in HAG inflammation,and the possible mechanism of Mieyou decoction is to inhibit activation of IKKβ to prevent activation of NF-κB.

Mieyou decoction;Helicobacter pylori;gastritis;IKKβ;NF-κB； mice；Scutellaria； Dandelion； cuttlefish bone

*王小娟，E-mail:shihuajin83@163.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2011.01.009.033.03

2010－11－26

湖南省自然科學基金項目（06JJ4038）；湖南省教育廳資助科研項目（07c496）。

施花錦（1983-），女，江西宜春人，碩士研究生，研究方向消化系統疾病。