人胃癌MGC803細胞紫杉醇耐藥細胞系初步建立的實驗研究

張 萌，費洪新，丁晨羲，韓婷婷

齊齊哈爾醫學院組織學與胚胎學教研室，黑龍江齊齊哈爾 161000

紫杉醇（paclitaxel，PA）是重要的抗腫瘤藥物，對晚期乳腺癌、鼻咽癌、肺癌、淋巴瘤等均有一定療效，為周期特異性的藥物，被認為是一種廣譜抗癌藥物。PA是最好的天然抗癌藥物之一，其藥理作用獨特。PA是四環二萜類生物堿，分子式為C47H51O14N，具有高度親脂性，不溶于水，但能溶于甲醇、乙醇、乙醚等有機溶劑，血漿蛋白結合率為95%等特性[1-2]。在體外建立多藥耐藥細胞系是研究腫瘤產生多藥耐藥性的重要方法。目前國內外尚缺乏人胃癌MGC803/PA的理想的細胞模型，實驗采用逐漸增加藥物PA濃度，建成人胃癌MGC803/PA耐藥細胞系，研究耐藥過程中細胞株的變化，建立理想的耐藥細胞模型。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

MTT上海華舜生物工程有限公司；紫杉醇（PA）Gibcoq/BRL公司（USA）提供；長春新堿（VCR）上海華聯藥業有限公司生產；5-氟尿嘧啶（5-FU）上海旭東海普藥業有限公司；絲裂霉素（MMC）；阿霉素（ADM ）澳大利亞F.H.Faulding公司生產；RPMI-1640由F.H.Faulding公司提供。

1.2 細胞培養

人MGC803為人胃癌細胞系，哈爾濱醫科大學黃小義博士提供。購買人胃癌MGC803細胞，細胞培養在經過0.22 μm濾膜過濾的RPMI-1640培養液中，在無菌溫箱進行培養，用PBS配制的0.15%的胰蛋白酶消化細胞傳代，每周傳代2次，收集生長旺盛的腫瘤MGC803細胞用于實驗研究。

1.3 耐藥細胞系的建立

選取生長旺盛的細胞MGC803細胞培養在培養液中，從0.05 μg/ml作用濃度開始，2 d后棄去培養液，加入新鮮的培養液，繼續培養MGC803細胞，MGC803細胞恢復正常生長在消化傳代MGC803細胞后繼續用0.05 μg/ml的藥物濃度處理MGC803細胞2 d，繼續反復換液處理、傳代逐步提高PA濃度誘導MGC803細胞，最后獲得一株能耐受0.5 μg/ml的MGC803細胞株，擬命名為MGC803/PA，并且將MGC803培養在含有0.1 μg/ml的完全培養液中進行培養，還要經常凍存細胞，觀察細胞凍存后的復蘇狀況。

1.4 MGC803細胞的生長抑制結果

選取對數生長期的MGC803細胞，接種于培養板中，每孔200 μl，一種細胞設3個復孔，培養箱內培養。每天取一塊培養板，棄培養液，加入無血清培養液180 μl，每孔加入MTT（5 g/L）20 μl，繼續培養 4 h，終止培養，棄培養液，加入 DMSO液體150 μl，振蕩，用全自動酶標儀測定570 nm光吸收值，以空白Control孔調零，以時間為橫坐標，細胞抑制率為縱坐標，分別測定不同濃度的PA對MGC803細胞分別在不同時間的生長抑制率，繪制細胞生長抑制曲線。

1.5 MTT法測定藥物的毒副作用

選用培養板內加入MGC803細胞混合液，每孔加入200 μl，加入倍比稀釋成5種濃度的各種抗癌藥物20 μl，對照組加入等體積的生理鹽水，設立空白對照組，放置于孵箱中培養68 h后棄液，每孔中加入不完全培養液180 μl及其5 g/L的MTT 25 μl，繼續培養 4 h 后小心棄液，每孔 DMSO 150 μl，置于微量振蕩器上振蕩5 min，用全自動酶標儀測定570 nm光吸收值，以空白Contro1孔調零。計算細胞生長抑制率和耐藥指數。

1.6 細胞形態學觀察

1.6.1 光學顯微鏡觀察 將MGC803細胞混合液接種于培養板，置于孵箱內培養3 d后用PBS洗滌3次，HE及其瑞氏染液染色15 min，再用PBS洗滌2次，常溫干燥，鏡下觀察。1.6.2電子顯微鏡觀察 選用MGC803細胞消化后的混合液，收集細胞，用戊二醛固定，四氧化鋨固定，脫水、包埋、切片和染色，按常規處理，透射電鏡鏡下觀察。

2 結果

2.1 MTT法檢測MGC803細胞

MGC803/PA細胞對PA的2、3、4個月耐藥指數分別是5.12、11.46、15.98，并且對另外幾種抗癌藥物也有一定程度的耐藥現象（表1～4）。觀察半數抑制濃度（IC50）的改變，細胞耐藥指數（RI）的改變。

表1 對照組MGC803藥物敏感性的觀察

表2 MGC803細胞藥物處理2個月藥物敏感性的觀察

表3 MGC803細胞藥物處理3個月藥物敏感性的觀察

表4 MGC803細胞藥物處理4個月藥物敏感性的觀察

2.2 細胞光鏡及電鏡下觀察

2.2.1 細胞光鏡下觀察 MGC803細胞與MGC803/PA細胞均呈均勻排列，細胞形態不規則，多邊形；MGC803細胞邊界清楚，細胞核較大，核仁明顯，細胞核有凹陷。MGC803/PA細胞隨著PA藥物劑量的增加，藥物作用時間的延長，處理4個月時出現MGC803/PA細胞的細胞邊界不清楚，細胞體積略微增大，細胞核不規則，有時出現較大的凹陷或者巨細胞，見圖1。

2.2.2 細胞電子顯微鏡觀察 紫杉醇加入藥物2個月后MGC803與MGC803/PA線粒體數目沒有差別，紫杉醇加入3個月后MGC803與MGC803/PA糖原減少，紫杉醇加入藥物4個月后MGC803與MGC803/PA線粒體數目減少，可見到假性包涵體（圖2）。

2.3 細胞生長和群體倍增時間

人腫瘤胃癌MGC803細胞株與MGC803/PA細胞株的生長周期不同，群體倍增時間分別為2個月為34.70、41.31 h；3個月為 26.42、51.23 h；4 個月為 27.34、55.92 h；耐藥細胞較親代細胞在相同的時間條件下分別延長了6.61、24.81、28.58 h，可以發現細胞的群體倍增時間是逐漸延長的（圖3）。

3 討論

目前國內外建立腫瘤耐藥細胞系的方法通常是藥物濃度遞增持續法和大劑量間歇誘導法。腫瘤多藥耐藥產生是與腫瘤細胞表面過剩表達一種P-糖蛋白有關，分子量為1.7×105。P-糖蛋白具有將抗腫瘤的藥物泵出細胞，細胞內的藥物濃度降低，從而減少藥物對細胞內細胞器的損傷，同時研究表明多藥耐藥基因相關蛋白與腫瘤多藥耐藥也密切相關[3-5]。引起耐藥機制可能是P-糖蛋白和藥耐藥基因相關蛋白的作用底物不同所造成。

應用逐漸增加抗腫瘤藥物PA的濃度，誘導MGC803細胞耐藥，經過4個月建成人胃癌MGC803耐藥細胞系，并且命名為MGC803/PA。光鏡下觀察MGC803/PA細胞與其MGC803細胞存在較大形態差異，MGC803/PA細胞邊界不清楚，細胞體積略微增大，細胞核不規則，有時出現較大的凹陷或者巨細胞。MGC803/PA巨細胞的出現提示細胞受到損傷、細胞分裂減少。在電子顯微鏡下觀察下，可以見到MGC803/PA細胞核大、細胞核畸形、細胞質內有假性包涵體、微絨毛較多，可見細胞核分裂的現象，這些均表明MGC803/PA細胞生長代謝緩慢、分裂活動減弱等。人胃癌MGC803/PA細胞通過研究細胞生長曲線測定群體倍增時間發現2、3、4個月MGC803/PA細胞較MGC803細胞延長的時間分別為6.61、24.81、28.58 h，提示人胃癌MGC803/PA細胞對化療的敏感性就下降，療效相對較差，治療上就必須加大藥物的劑量。

體外建立的耐藥細胞對PA的相對耐受度較親代細胞2、3、4 個月分別提高的指數是 5.12、11.46、15.98。 表明MGC803 細胞耐藥是逐漸形成的，一般是PA持續作用MGC803細胞3個月就可以把MGC803細胞耐藥了，同時使細胞總是處于一個較大的劑量的藥物環境中，同時還要經常復蘇細胞，耐藥性能方可以穩定下來。MGC803/PA細胞表現出較為穩定的耐藥性，MGC803/PA細胞凍存后復蘇后狀態良好。MGC803/PA細胞系不僅對PA產生耐藥，而且對從未接觸的ADM等多種抗癌藥物也產生不同程度的耐藥性，說明MGC803/PA細胞系耐藥性能相對穩定，是篩選逆轉劑建立理想的耐藥細胞模型。

綜上所述，MGC803/PA細胞具有耐藥表型，且耐藥性能穩定，MGC803/PA的增殖能力逐漸下降，MTT法及其電鏡可以較早地提示MGC803/PA的耐藥特征。實驗中細胞生長曲線、MTT、電子顯微鏡等檢測方法是逐漸改變MGC803細胞，MTT法和電子顯微鏡與其他的檢測相比較好，但成本較高。因此，建立MGC803耐藥細胞系的過程中，MTT法是首選的檢測方法，后續的工作中尚需要進行流式細胞儀及其蛋白質印記進行檢測此耐藥細胞株的穩定性。

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